研究生课程荧光光谱

1、LOGO 现代仪器分析现代仪器分析 荧光分析法荧光分析法 LOGO 第一节第一节 概述概述 一、分子发光一、分子发光 某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激 发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。 二、分子发光类型二、分子发光类型 1 1、 按激发模式按激发模式 光致发光光致发光 ：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激 发所产生的发光现象。发所产生的发光现象。 化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提 供的发光现象

2、。供的发光现象。 LOGO 生物发光：分子的激发能量是由生物体释放生物发光：分子的激发能量是由生物体释放 出来的能量所提供所产生的发光现象。出来的能量所提供所产生的发光现象。 2 2、按分子激发态的类型来划分、按分子激发态的类型来划分 荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射 跃迁而伴随的发光现象。跃迁而伴随的发光现象。 磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐 射跃迁而伴随的发光现象。射跃迁而伴随的发光现象。 LOGO 第二节第二节 分子荧光分析法及其基本原理分子荧光分析法及其基本原理 一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与

3、磷光的产生过程 1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态基态( (S S0 0)激发态激发态( (S S1 1、S S2 2、激发态振动能级激发态振动能级) )： 吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速；速 度最快、激发态寿命最短的途径占优势；度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S S1 1 、 、S S2 2 ； 第一、

4、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T T1 1 、 、 T T2 2 ； LOGO 2.2.电子激发态的多重态电子激发态的多重态 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相应，三重态能级比相应 单重态能级低；单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； S S0 0T T1 1 禁阻跃迁；禁阻跃迁； 通过其他途径进入通过其他途径进入 ( (见能级图见能级图) )；进入的；进入的 几率小；几率小； LOGO 3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态

5、时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径传递途径 辐射跃迁辐射跃迁 荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预 无辐射跃迁无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大；发光强度相对大； 荧光：荧光：1010-7 -7 1010-9 -9s, s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态； 磷光：磷光：1010-4 -4 1010s s

6、；第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态；基态； LOGO （1）无辐射能量传递过程）无辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式 由高振动能级至低相邻振动能级间由高振动能级至低相邻振动能级间 的跃迁。的跃迁。1010-12 -12s s。 。 内转换：同多重态电子能级中内转换：同多重态电子能级中, ,等能级间的无辐等能级间的无辐 射能级交换。射能级交换。 1010-11 -11s s 1010-13 -13s s 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电 子跃回第一激发单重态的最

7、低振动能级。子跃回第一激发单重态的最低振动能级。 LOGO 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁；相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。 系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态, ,有重叠的转动能级间的有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。非辐射跃迁。 1010-2 -2s s 1010-6 -6s s 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨轨 道耦合进行。道耦合进行。 LOGO （2）辐射能量传递过程）辐射能量传递过程 荧光发射：电子由

8、第一激发单重态的最低振动荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动 能级能级基态（基态（ 多为多为S S1 1S S0 0跃迁），跃迁）， 发射波长为发射波长为 2 2的荧光。的荧光。 10 10-7 -7 10 10 -9 -9 s s 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长 长；长； 2 2 2 2 1 1 ； 延迟荧光：分子跃迁至延迟荧光：分子跃迁至T T1 1态后，因相互碰撞或态后，因相互碰撞或 通过激活作用又回到通过激活作用又回到S S1 1态，经振动态，经振动 驰豫到驰豫到S S1 1态的最低振动能级再发射态的最低振动能级再发射 荧光。荧光。 L

9、OGO 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动 能级能级基态（基态（ T T1 1 S S0 0跃迁）；跃迁）； 电子由电子由S S0 0进入进入T T1 1的可能过程：的可能过程：S S0 0T T1 1禁阻跃迁禁阻跃迁 S S0 0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振振 动弛豫动弛豫 T T1 1 发光速度很慢：发光速度很慢： 1010-4 -4 100 s 100 s 。光照停止后，。光照停止后， 可持续一段时间。可持续一段时间。 LOGO （3 3）瑞利散射光和拉曼光）瑞利散射光和拉曼光 瑞利散射光瑞利散射光 激发光的能量不

10、足，将电子激发至基态中较高的振激发光的能量不足，将电子激发至基态中较高的振 动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬 时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和 激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。 拉曼光拉曼光 被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返 回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长 略长或略短于激发光波长的拉曼散射光。略长或略

11、短于激发光波长的拉曼散射光。 LOGO S2 S1 S0 T1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 发发 射射 磷磷 光光 系间跨越系间跨越 内转换内转换 振动弛豫振动弛豫 能 量 l 2l 1 l 3 外转换 l 2 T2 内转换内转换 振动弛豫 LOGO 二、分子荧光分析的基本原理二、分子荧光分析的基本原理 1 1、激发光谱与荧光、激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 （1 1）. .荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱的激发光谱 曲线曲线 固定测量波长固定测量波长( (选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发化合物发 射的荧光射的荧光( (磷光磷光) )强度与照射光波长的关系

12、曲强度与照射光波长的关系曲 线线 （图中曲线（图中曲线I I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子 最多，荧光强度最大。最多，荧光强度最大。 LOGO （2）.荧光光谱荧光光谱 (或磷光光谱或磷光光谱 ) 固定激发光波长固定激发光波长( ( 选最大激发波长选最大激发波长), ), 化合物发射的荧光化合物发射的荧光( (或或 磷光强度磷光强度) )与发射光波与发射光波 长关系曲线长关系曲线( (图中曲线图中曲线 IIII或或IIIIII) )。 LOGO 200260320380440500560620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发

13、射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 LOGO （3）.激发光谱激发光谱 与发射光谱与发射光谱 的关系的关系 .Stokes.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱发射光谱 的波长的波长（emem）比激发光谱的波长比激发光谱的波长（exex）长，长，振振 动弛豫消耗了能量。动弛豫消耗了能量。 . .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的量

14、，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的 最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 光。光。 LOGO LOGO .镜像规则镜像规则 基态上的各振动能级分布基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级与第一激发态上的各振动能级 分布类似；分布类似； 基态上的基态上的 零振动能级与零振动能级与 第一激发态的第一激发态的 二振动能级之二振动能级之 间的跃迁几率间的跃迁几率 最大，相反跃最大，相反跃 迁也然迁也然。 LOGO 200250300350400450500 荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光

15、谱蒽的激发光谱和荧光光谱 LOGO 2 2、 荧光强度及其与浓度的关系荧光强度及其与浓度的关系 （1 1）量子产率及影响因素）量子产率及影响因素 表示物质发射荧光的能力表示物质发射荧光的能力 。 = = 发射的光子数发射的光子数 / / 吸收的光子数吸收的光子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于 激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁， 因而荧光量子产率也可表示为：因而荧光量子产率也可表示为：

16、=k=kf f/(k/(kf f+K)+K) k kf f：辐射跃迁速率，：辐射跃迁速率，K K：非辐射跃迁速率：非辐射跃迁速率 LOGO （2 2）荧光强度与浓度的关系）荧光强度与浓度的关系 在稀溶液中（在稀溶液中（ bcbc0.05)0.05)，荧光强度与荧光物质的，荧光强度与荧光物质的 浓度成正比。浓度成正比。 I If f =2.3 =2.3 I I0 0 bcbc 荧光强度荧光强度I If f正比于吸收的光量正比于吸收的光量I Ia a与荧光量子产率与荧光量子产率 。 在一定条件下：在一定条件下： I If f = K c= K c 在浓溶液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降在浓溶

17、液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降 a a 因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大 降低；降低； b. b. 溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分 子与基态分子形成复合物；子与基态分子形成复合物； c c 自吸收。自吸收。 LOGO 3. 3. 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系 （1 1）分子产生荧光必须具备两个条件：）分子产生荧光必须具备两个条件： a. a.具有合适的结构；具有合适的结构； b. b.具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。 （2 2）化合物的结构与荧光

18、）化合物的结构与荧光 共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率 并产生红移。并产生红移。 a a 芳环越大芳环越大, ,荧光峰越移向长波方向荧光峰越移向长波方向 b b 同一共轭环数的芳族化合物同一共轭环数的芳族化合物, ,线性环结构者荧线性环结构者荧 光波长比非线性者要强。光波长比非线性者要强。 LOGO 刚性平面结构刚性平面结构 可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故 具有很强的荧光。具有很强的荧光。 a a 试剂本身有刚性平面结构试剂本身有刚性平面结构 LOGO b b 形成络合物后形成络合物后, ,形成刚性平

19、面形成刚性平面 滂铬兰黑滂铬兰黑R R（BBRBBR）无荧光，它与铝形成螯合物有荧）无荧光，它与铝形成螯合物有荧 光。光。 LOGO c c 取代基之间形成氢键取代基之间形成氢键 加强了分子刚性结构和增强荧光强度。加强了分子刚性结构和增强荧光强度。 d d 异构体的影响异构体的影响 顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。 CC H H CC HH LOGO 取代基效应取代基效应 芳环上有供电基，使荧光增强。芳环上有供电基，使荧光增强。 a a 给电子基团常使荧光增强给电子基团常使荧光增强; ; 取代基对苯荧光的影响取代基对苯荧光的影响( (乙醇溶液乙醇

20、溶液) ) 化合物化合物 分子式分子式 荧光波长荧光波长(nm) (nm) 荧光相对强度荧光相对强度 苯苯 C C6 6H H6 6 270310 10 270310 10 苯酚苯酚 C C6 6H H5 5OH 285365 18OH 285365 18 苯胺苯胺 C C6 6H H5 5NHNH2 2 310405 20 310405 20 苯基氰苯基氰 C C6 6H H5 5CN 280390 20CN 280390 20 苯甲醚苯甲醚 C C6 6H H5 5OCHOCH3 3 285345 20 285345 20 LOGO b b 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光吸电子基团会减弱甚至

21、破坏荧光; ; c c 邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧 光。光。 d d 重原子引入体系，荧光强度都很弱，而磷光重原子引入体系，荧光强度都很弱，而磷光 强度相应增强。强度相应增强。 e e 与与电子体系作用小的取代基电子体系作用小的取代基, , 影响小。影响小。 LOGO 跃迁类型跃迁类型 * * 的荧光效率高，系间跨越过程的速率的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生。常数小，有利于荧光的产生。 LOGO LOGO 4 4、 影响荧光强度的主要因素影响荧光强度的主要因素 （1 1）荧光猝灭）荧光猝灭 自猝灭自猝灭 a. a. 荧

22、光辐射的自吸收；荧光辐射的自吸收； b. b. 荧光物质的激发态分子荧光物质的激发态分子M M* *与基态分子与基态分子M M形成形成 激发态的二聚体（激发态的二聚体（M M* *M M）；）； c. c. 基态的荧光物质分子的缔合。基态的荧光物质分子的缔合。 电荷转移猝灭电荷转移猝灭 激发态分子比基态具有更强的与其他物质发激发态分子比基态具有更强的与其他物质发 生氧化还原反应的能力，从而导致荧光猝灭。生氧化还原反应的能力，从而导致荧光猝灭。 LOGO 转入三重态猝灭转入三重态猝灭 发生发生S S1 1T T1 1间的系间窜跃，把多余的能量消间的系间窜跃，把多余的能量消 耗于碰撞之中使荧光猝灭

23、。耗于碰撞之中使荧光猝灭。 （2 2）温度、酸度和溶剂的影响）温度、酸度和溶剂的影响 温度温度 随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光 量子产率和荧光强度将增大。量子产率和荧光强度将增大。 酸度酸度 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pHpH的影响较大，需要严的影响较大，需要严 格控制。格控制。 LOGO 溶剂溶剂 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配 位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。 （3 3）表面活性剂的影响）表面活性剂的影响 增溶增溶 增敏增敏 a a 提高荧光量子

24、产率提高荧光量子产率; ; b b 提高提高。 增稳增稳 LOGO 第三节：荧光分析仪器第三节：荧光分析仪器 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图： 单色器：选择激发光波长单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射的第一单色器和选择发射 光光( (测量测量) )波长的第二单色波长的第二单色 器；器； 光源：灯和高压汞灯，染光源：灯和高压汞灯，染 料激光器料激

25、光器( (可见与紫外区可见与紫外区) ) 检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。 LOGO 仪仪 器器 光光 路路 图图 LOGO 一、基本装置及主要构件一、基本装置及主要构件 1 1、激发光源、激发光源 （1 1）条件）条件 足够的强度足够的强度 紫外，可见区域有连续的光谱紫外，可见区域有连续的光谱 强度与波长无关强度与波长无关 光强稳定光强稳定 （2 2）激发光源）激发光源 氙灯（高压）氙灯（高压）:250:250800nm800nm光谱区呈连续光谱，氙灯光谱区呈连续光谱，氙灯 使用寿命大约为使用寿命大约为2000h2000h。 汞灯（高压）汞灯（高压）: :在紫外区激发，在紫外区激发，

26、365nm365nm，使用寿命，使用寿命 1500 150030003000小时。小时。 LOGO 2 2、单色器、单色器 光栅单色器光栅单色器 有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱， 主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可 用前置滤光片加以消除。用前置滤光片加以消除。 滤光片滤光片 滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有 广泛的应用。广泛的应用。 3 3、样品池、样品池 石英方形池，四面都透光。石英方形池，四面都透光。 4 4、狭缝、狭缝

27、狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。 LOGO 5 5、检测器、检测器 光电倍增管：灵敏度高，线路简单。光电倍增管：灵敏度高，线路简单。 光电摄像管：具有检测效率高，动态范围光电摄像管：具有检测效率高，动态范围 宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。 6 6、读出装置、读出装置 记录仪、阴极示波器和显示器。记录仪、阴极示波器和显示器。 二、常用的一些荧光分光计二、常用的一些荧光分光计 1 1、 YF 1 YF 1 型荧光分光计型荧光分光计 手控式荧光分光计手控式荧光分光计 2 2、 YF2YF2型荧光分光计型

28、荧光分光计 自动记录式自动记录式 3 3、微机化荧光分光计、微机化荧光分光计 970 CRT 970 CRT型荧光分光光度计；日立型荧光分光光度计；日立F2500 RF540 F2500 RF540 LOGO 磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法： （1 1）通常借助于荧光和磷）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。 （2 2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨

29、技术。检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要室温测量时，不需要 杜瓦瓶。杜瓦瓶。 LOGO 第四节第四节 荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用 一、荧光定量分析方法一、荧光定量分析方法 定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 I If f正比于正比于吸收的光量吸收的光量I Ia a和荧光量子效率和荧光量子效率 ： I If f = = I Ia a 由朗伯由朗伯- -比耳定律：比耳定律： I Ia a = = I I0 0(1-10(1-10- - l c l c ) ) I If f = = I I0 0(1-10(1-10- - l c l c ) = ) = I I0 0(1-(1-e e

30、-2.3 -2.3 l c l c ) ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： I If f = 2.3 = 2.3 I I0 0 l c l c = = KcKc LOGO 1 1 标准曲线法标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘 制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的 荧光强度，在标准曲线上求出浓度荧光强度，在标准曲线上求出浓度 2 2、比较法、比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强在线性范围内，测定标样和试样的荧光强 度，比较。度，比较。 LOGO 3 3、 多组分混合物的荧光分析多组分混