《酶切回收连接》

1、基因工程的基本过程基因工程的基本过程 2 质粒质粒DNA的酶切的酶切 3 定义：识别定义：识别dsDNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点并在识别位点 或其周围切割双链或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 4 类内切酶作用特点类内切酶作用特点 v能在特殊位点识别和切断能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列，识别序列4-6bp， 具有具有回文结构回文结构 （180度旋转对称结构）度旋转对称结构） vHind v产生产生5粘性末端粘性末端 5 vSst 产生产生3粘性末端粘性末端 6 GTC CAG GTCGAC CAGCTG GAC CTG

2、7 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株；第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 3、命名、命名： Hind Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 属属 系系 株株 序序 v书写方法：前书写方法：前3个字母斜体个字母斜体 8 酶活性单位酶活性单位 v指在限定条件下（温度、指在限定条件下（温度、Buffer），），1hr消化消化 1ugDNA

3、的酶量称为一个酶单位（的酶量称为一个酶单位（unit）。）。 v实际工作中，为保证消化完全，实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化的消化 需要需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，个单位的酶，反应时间也要适度延长， 通常是反应过夜。通常是反应过夜。 9 酶切反应系统的设计酶切反应系统的设计 v回收回收DNA通常酶切通常酶切10g v实际酶的用量应是理论用量的实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。倍。 v酶通常保存在酶通常保存在50%的甘油中的甘油中 ，使用时甘油浓度，使用时甘油浓度 必须小于必须小于5%，故酶至少稀释，故酶至少稀释10倍。倍。 vBuffer通常是通常是10，使用时

4、稀释，使用时稀释1010倍。倍。 v总反应体积总反应体积20-50ul20-50ul，不足用，不足用tdHtdH2 2O O补足。补足。 10 DNA的量的量酶的用量（酶的用量（U/C） 酶在酶在50甘油中，甘油在甘油中，甘油在 总体积的浓度要小于总体积的浓度要小于5 反应的反应的 总体积总体积 Buffer的体积的体积水的体积水的体积 11 质粒质粒DNA 15l （10g） Hind III (20U/l) 1.5 l 10 缓冲液缓冲液 E 3l 三蒸水三蒸水 9l _ 总体积总体积 30l XbaI（20U/l 1.5 l 加样顺序加样顺序 加样后混匀，短暂离心，使之至管底。加样后混匀

5、，短暂离心，使之至管底。 12 DNA片段的片段的 分离纯化分离纯化 13 四、操作步骤：四、操作步骤： 关键操作：点样关键操作：点样 n在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿 孔底孔底 1.加样器一旦按下，就一定保持按住直至加加样器一旦按下，就一定保持按住直至加 样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到 tip中，使加样失败中，使加样失败 14 载体载体 DNA 目的目的 基因基因 bp 1534 994 695 515 377 237 A B C M 16 酚抽提法酚抽提法 切下含目的切下含目的DNA的胶块。的胶块。 加入酚

6、，将胶块没过即可。加入酚，将胶块没过即可。 振荡后低温冻结，视温度而定时间。振荡后低温冻结，视温度而定时间。 30水浴融化，若体积小，可补加水浴融化，若体积小，可补加TE。 振荡器上振荡。振荡器上振荡。 12,000 rpm离心离心5 min。 取上清取上清200l。 17 用用200l的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心 12000 rpm，5 min，取上清）。，取上清）。 加加20 l NaAc，400 l无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀DNA，冰，冰 冻约冻约30 min甚至过夜。甚至过夜。 12,000 rpm离心离心10 min，弃上清。，弃上清。 将将DNA溶于约溶于约30l TE中。中。 18 DNA片段的连接反应片段的连接反应 19 DNA 连接酶连接酶 ligase 催化催化DNA 5 DNA 5 磷酸基与磷酸基与 3 3 羟基之间形羟基之间形 成磷酸二酯键成磷酸二酯键(ATP)(ATP) 5 53 3 OH P OHP DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶 20 总体积总体积20 l 载体载体 0.10.2g 目的基因：载体目的基因：载体mol数数= 15：1 H2O 10buffer 载体载体 目的基因目的基因 ligase 总体积总体积 20l l l l l l