复合型脑肿瘤组织及细胞芯片的构建

1、复合型脑肿瘤组织及细胞芯片的构建【摘要】 目的：探讨一种复合型脑肿瘤组织及细胞 芯片的构建方法。方法：设计布有各级别胶质瘤瘤组织、人 脑胶质瘤培养细胞共 99 例的复合芯片，应用组织芯片仪制 作芯片蜡块， 切片后进行的 Rb“ EnVision ”法免疫组化染色。 结果：含有脑肿瘤组织及体外培养瘤细胞的组织芯片排列整 体，免疫组化染色效果好。结论：应用组织芯片制作技术构 建复合型脑肿瘤组织及细胞芯片简单易行，结果可靠，开创 了一种制作脑肿瘤复合生物芯片的方法。【关键词】 组织芯片； 复合生物芯片； 石蜡 中图分类号 R730.264 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2015）23

2、-0012-02Construct Compound Biochip Containing Brain Tumor Tissues and Cells/ZHAI De-zhong ， LI Xue-wen ，LIANG He ， et al./Chinese and Foreign Medical Research ，2015，13（ 23）： 12-13【Abstrat 】 Objective ：To explore a novel method of constructing compound biochip containing brain tumor tissues and gliom

3、a cells cultured in vitro.Method ： To design cell microarrays containing 99 specimens ， including human glioma tissues and glioma cells cultured in vitro.A tissue microarray instrument was used to fabricate tissues and cell microarray paraffin blocks ， which were made into slices and immunohistochem

4、istry staining for Rb by “ EnVision ” method.Result： The dots of microarrays arranged orderly ， its morphology were preserved well and effect of immunohistochemistrical staining were reliable.Conclusion ： Using Tissue Microarray Technique to fabricate compound biochip containing brain tumor tissues

5、and glioma cells is simple， reliable and cost-effective ， which innovates a novel technology for establishing compound biochip.【Key words 】 Tissue microarray ； Compound biochip ； ParaffinFirst-author s address： The Peoples Hospital of Dingxi City ， Dingxi 743000 ，Chinadoi ： 10.14033/ki.cfmr.2015.23.

6、005 复合型生物芯片是近几年发展起来的一种新型生物芯 片，因其信息量大、并行采集等特点，使其成为生物信息学 研究中的一个重要信息采集和处理平台。目前已有多种复合 型生物组织及细胞芯片的构建方法，但这类芯片多存在操作 复杂，成本高昂等缺点。如何能开发出一种制作简单、成本 低廉的复合型生物组织及细胞芯片制作方法势在必行 1-4 。 笔者曾成功构建过脑肿瘤组织芯片和细胞免疫芯片，现尝试 应用组织芯片制作技术将脑肿瘤组织和体外培养的脑肿瘤 细胞固定在同一载体上制成复合型脑肿瘤组织及细胞芯片， 开创一种复合生物芯片的制作方法。1 材料与方法1.1 材料各种脑肿瘤组织共 79 例来自 2003 -201

7、3 年定西市人民 医院病理科库存标本，胶质瘤体外培养细胞 20 例来自苏州 大学附属第二医院脑肿瘤研究室；蜂蜡购自常州市飞勒斯仪 器有限公司；组织芯片仪为北京博医康实验仪器有限公司产 品，该组织芯片仪包括操作平台（即底座板样品架） ，特殊 打孔采样装置，前后左右上下移动和定位系统等组成。打孔 与采样管刀的重合可由螺钉调整，方便，可靠。前后左右位 移量有刻度显示和数字显示两种，方便、准确、直观。上下 移动的下止点由螺栓挡块调整，保证打孔深度和样品柱放置 的一致性。组织切片机为 Leica 公司产品； Rb 鼠抗人多克隆 抗体及免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公 司。1.2 方法1.2.

8、1 芯片的设计 拟将脑肿瘤组织标本和体外培养的 胶质瘤细胞布在同一载体上，载体选择经过特处理的玻片。在长45 mm x宽20 mm x高15 mm蜡块上构建12 x 10共120 点阵芯，点阵间距 0.6 mm 。为了防止在打点、切片、染色或 免疫组化过程中出现漏点，滑片及掉片现象，每个样本可以 上样 2个点，这样共布 99个标本。起始 2 个位点空缺，作 为起点标记。1.2.2 培养脑肿瘤细胞块的石蜡包埋 将培养细胞收集在锥形离心管内，用 2000 r/min速度离心5 min，弃上清液， 加入适量的10%中性福尔马林，摇匀后置4 C冰箱内固定45 min，用1500 r/min速度离心2

9、min弃上清液，用 PBS液洗涤 2 次。取适量微波炉加热溶解的2%琼脂糖滴于载玻片上，冷却至表面稍微凝固后用取样器吸取细胞注入琼脂糖 内，待完全凝固后常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成细胞蜡 块。1.2.3空白微阵列蜡块的制备取97.5 g莱卡石蜡+2.5 g蜂蜡（2.5%）混合，制成长 45 mm X宽20 mm X高15 mm的空白蜡块，在该蜡块 39 mm X 16 mm范围内设计 12X10 点组织陈列。 用组织芯片制作仪在受体蜡块上打孔， 孔 径1 mm。空白微阵列模块见图1。1.2.4 含组织、细胞微阵列蜡块的制备 将空白微阵列模 块放在56 C温控仪上烘10 min后，用打孔针从组

10、织块上逐 个取出靶标脑肿瘤组织，逐一放入预先设计的阵列模块中， 然后用同样方法将培养的瘤细胞放入微阵列模块中，形成含 有脑肿瘤组织和培养脑肿瘤细胞的复合微阵列块 （图 2）。将 构建好的芯片蜡块放入 55 C温箱中约10 min，在蜡将要完全溶解前，取出室温下冷却，使受体模块的蜡与新插入的小 圆柱状组织溶为一体，取下蜡块，于4 C冰箱中保存备用。125切片 切片前，蜡块需在4 C中预冷4 h左右，然 后夹在切片机上进行修正，等修到全部组织完整为止。用 -20 C预冷冰袋贴在蜡块上 510 min左右，快速连续切片 3050张，再用冰袋冷冻微阵列块，直至将组织切完为止。 将4卩m连续切片分别漂在

11、凉水中，让其自然展开，按顺序将切片转移至45 C的温水中展片2 min左右，将其贴在浸 有切片黏合剂的载玻片上晾干，60 C中烤片3 min左右，58 C中继续烤片18 h, -20 C保存备用。1.2.6 免疫细胞化学染色 对芯片进行一抗为 Rb 的免疫 组织化学染色， 采用 EnVision 法， 由笔者所在医院病理科完 成。2 结果成功制作 118 孔含 99 例脑肿瘤组织、细胞的微阵列蜡 块，载玻片上点阵无脱落。 HE 切片显示取样组织边缘锐利， 无明显组织挤压和结构变形，所取组织点阵符合研究要求 （图 3）。制作的芯片蜡块见图 2，免疫组化染色见（图 4）。3 讨论 组织芯片是生物芯

12、片技术的一个重要分支，是将许多不 同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行 同一指标的原位组织学研究 6。细胞芯片是将细胞按照特定 的方式固定在载体上，用来检测细胞间相互影响或相互作 用。单一的组织芯片或细胞芯片在实验研发和临床诊断工作 中受到很大制约，不能进行组织及细胞间的比对研究，不能 观察细胞内部结构，浪费昂贵的抗体，浪费时间等问题层出 不穷。如何解决这个问题呢？经过长期研究， 把细胞、 组织， 按照不同的目的要求，放置于同一载体上，制成相应的复合 型组织及细胞芯片应运而生。复合型生物组织及细胞芯片在 很多领域都有广泛的应用，它是在尽可能留取有用的生物信 息基础上，把组织与细

13、胞同时列阵于同一张载体，而细胞的 来源可以是血液细胞或者是培养的细胞，处理方法则完全改 变了传统涂片、 细胞培养的方法， 而是按照组织的处理方式， 把细胞集群经过特殊固定液固定，使其蛋白质凝固，能够与 组织标本形成相当硬度，然后，与组织一同经脱水、石蜡包 埋成蜡块。 再以组织芯片的制作方法， 按照不同的课题要求， 选取组织标本和细胞，列阵于载体上，以常规方法切片，完 成复合型组织及细胞芯片的制作。目前虽有多种复合型组织 及细胞芯片的构建方法，但都存在操作复杂，成本高昂等缺 点。本研究把细胞蜡块包埋技术和组织芯片制作技术相结 合，将体外培养的胶质瘤细胞及脑肿瘤组织标本构建在同一 载体上，开辟了一

14、种制作复合型组织及细胞芯片的方法。用 这种方法制作的复合型组织及细胞芯片具有以下几个优点：（1）所需设备简单，制作技术成熟，易于推广应用； （ 2）细胞石蜡包埋切片，可以进行细胞内部生物信息的观察与探索，改变了以往只能观察细胞表面结构的缺陷。 （ 3）细胞与 组织的生物信息在同一载体上的比对研究，提供细胞及组织 不同层面的生物信息； （ 4）将组织和细胞置于同一载玻片上， 实验条件的同一性减少了实验误差，其对比性强；（ 5）采用全新的组织处理方法进行细胞的脱水、包埋、切片、列阵， 重新诠释了细胞芯片的概念； （ 6）将培养脑肿瘤细胞与脑肿 瘤组织纳入同一载玻片上，有利于阐明脑肿瘤与细胞之间的

15、关系以及它们之间可能的相互转化机理。本项目复合脑肿瘤组织及细胞芯片尚少见报道，该项目 的成功开发，将产生系列产品和技术，在人体及动物医学的 教学、基础科研、临床疾病诊断等众多行业得到应用，对生 物芯片领域将起到巨大的推动作用。参考文献1 朱卿，黄强，翟德忠，等 .针对胶质瘤发生、发展分子 机制研究的组织芯片制作 J. 中华神经医学杂志， 2006，5（4）： 338-341.2 翟德忠， 柴玲霞，冯万文，等.应用组织芯片技术构建 细胞免疫芯片 J. 中国现代医学杂志， 2009，19（2）：213-215.3 霍红梅， 翟德忠，朱卿，等.脑胶质瘤分子病因相关组 织芯片 CyclinB1 表达及其临床意义的研究 J. 中华肿瘤防治 杂志， 2008， 15（13