遗传毒性试验123

1、1.遗传毒性试验 GBT16886.1-2001 持久表面粘膜接触类 持久损伤表面接触类 持久血路接触类 长期组织/骨/牙接触 长期循环血液接触 长期植入类医疗器械 2.遗传毒性试验涉及的医疗器械类样品 人工食道、接触眼镜、宫内节育器 创伤、愈合和保护用敷料（烫伤用敷料、 硅橡胶纱布） 3.遗传毒性试验内容 体外遗传毒性 哺乳动物细胞 畸变 哺乳动物细胞 基因突变 哺乳动物细胞 染色体畸变 细菌基因突变 Ames试验 遗传毒性-食品检测 Ames试验 和小鼠精子 细胞染色体 畸变试验 体外与体 内 原核与真 核 常染色体 与性染色 体 Ames试验 Ames试验原理 自发回 复菌落 空白对 照

2、 无组 氨酸 突变菌 落 阳性 无组 氨酸 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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7、. . . . . 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his ）菌株，在含微量组氨酸的培养基中， 除极少数自发回复突变的细胞外，一般只 能分裂几次，形成微菌落。 受诱变剂作用后，大量细菌发生回复突变， 自行合成组氨酸，发育成2倍以上阴性对照 的菌落数。 Ames试验流程 溶液和琼脂的配置 0.5mmol/L 组氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 顶层琼脂培养基 磷酸盐缓冲液 20%葡萄糖溶液 底层培养基 营养肉汤培养基 S9混合物 阳性物：敌克松（TA97、TA98和TA102）， 1.0mg/ml，用DMSO配制；叠氮钠 （TA100）,1.0mg/ml。 活化组用2-蒽基芴 （TA97,

8、TA98,TA100），0.1mg/ml;1,8-二羟基蒽醌 （TA102）0.6mg/ ml. 菌株鉴定 菌株购买，投入使用前 准备冻存菌株时 对诱变剂丧失敏感时 自发图变数不在正常范围时 鉴定内容 组氨酸缺陷型鉴定 脂多糖屏障缺失鉴定 R因子鉴定 四环素鉴定 紫外线照射修复鉴定 自发回复突变鉴定 组氨酸缺陷性鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102 无组氨酸有组氨酸 脂多糖屏障缺陷鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102 结晶紫染色 沾有结晶沾有结晶 紫的滤纸紫的滤纸 片片 R因子鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102

9、青霉素 沾有青霉沾有青霉 素滤纸片素滤纸片 四环素鉴定 TA98 TA102 四环素 沾有四环沾有四环 素滤纸片素滤纸片 uvrB突变鉴定 TA97 TA98 TA100 TA102 紫外线照紫外线照 射射8s 33cm 自发回复突变鉴定 底层培养基 顶层培养基+菌液 每个菌株做 两个平行皿 菌株菌株自发回复图变数自发回复图变数 TA9790180 TA983050 TA100100200 YA102240320 平板渗入试验 配试剂高压烘干 倒平板 接种菌株， 摇菌 试验前准备 样品剂量设定 0.2g/ml0.1g/ml0.05g/ml0.025g/ml0.0125g/ml 平板分组 阴性阴

10、性阴性阴性 阳性阳性 阳性 阳性 样品样品样品样品 TA97 TA98TA100TA102 平板分组 阴性 阳性 样品 TA97 TA97 S9 阴性 TA97 +S9 阴性 TA97 S9 阴性 TA97 +S9 阴性 TA97 S9 阳性 TA97 +S9 阳性 TA97 S9 阳性 TA97 +S9 阳性 TA97 S9 样品高剂 量 TA97 +S9 样品高剂 量 TA97 S9 样品高剂 量 TA97 +S9 样品高剂 量 试验 底层培养基 样品液 0.1ml 菌液 0.1ml 活化组 加S9溶 液0.5ml 每支试管 结论判断 倒置培养48h后，计算每皿菌落数。 阴性对照组回变菌落

11、数应在预期范围内，阳性 对照组回变菌落数应至少为预期范围的3倍。 否则对不在范围内的菌株应重新试验。 试验样品组变异频率比阴性对照至少增加两倍 （即回变菌落数2阴性对照数）即为阳性 反应。 只要有一个试验菌株，无论在加S9 或未加S9 条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙 门氏菌为致突变阳性 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 试验原理 在加入和不加入代谢活化系统的条件下， 使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。 用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水 仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相， 随后收获细胞，制片，染色，分析染色体 畸变。 试验流程 传代细胞到六孔板 染毒 换液，继续培养 秋水仙素处理

12、，收细胞，制片 染毒 样品设计三个剂量，0.2g/ml 0.1g/ml 0.05g/ml 染毒过程分加S9混合物和不加S9混合物 阴性 S1 阴性 S1 S2 S2 S3 S3 阳性 阳性 -S9&+S9 -S9阳性对照为 甲磺酸甲酯 +S9阳性对照为 环磷酰胺 秋水仙素处理，收细胞，制片 消化细胞后加含血清培养液，以1200 r/min 离心7min，弃上清。 加入0.075mol/L氯化钾溶液7ml，于37水 浴低渗处理7min，加入2ml固定液，以 1500r/min离心5min7min，弃去上清液。 再加入7ml固定液，固定7min，以1500r/min 离心7min，弃上清。同法再固

13、定12次，弃 上清，加入数滴新鲜固定液自然干燥，用 姬姆萨染液染色。 制片 秋水仙素处理4h 消化细胞，1200rpm 离心7min 0.075mmol/L氯化钾 低渗处理7min后加固 定液，1500rpm， 7min 加固定液7ml，7min 后1500rpm离心7min， 重复两次 滴片吉姆萨染色 结论判断 在光学显微镜下每一试验组选择100个分散良 好的中期分裂相进行染色体畸变分析 染色体结构异常包括：裂隙、断裂、微小体， 单体互换等 用2 检验或其他适当的显著性检验方法，对所 得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴 性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显 著性意义，并有剂量-反

14、应关系时； 或仅一个 剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证 实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变 性。 当畸变率4.9%为阴性，5.0%9.9%为可疑阳 性，10%19.9%为+，20%49.9%为+， 50%为+ 注意事项 1.剧毒物质：敌克松、叠氮钠、2-蒽基芴、 1,8-二羟基蒽醌、多氯联苯、甲磺酸甲酯 2.操作中，避免菌株的交叉污染 3.废弃菌液煮沸10min处理 4.低渗时间的把握 5.染色体结构异常的判断 扩项的实验设备和试剂 Ames实验 培养箱、水浴摇床、水浴箱、灭菌器、烘 箱、普通冰箱、液氮灌、电子天平等 组氨酸、生物素、琼脂粉、氯化钠、柠檬 酸、磷酸氢二钾、磷酸氢氨

15、钠、硫酸镁、 葡萄糖、牛肉膏、胰胨、氯化钾、氯化镁、 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、辅酶2、6-磷酸 葡萄糖、氨苄青霉素、四环素、结晶紫、 体外哺乳动物细胞染色体 畸变 超净工作台、离心机、倒置显微镜等 甲磺酸甲酯、环磷酰胺、DMSO、秋水仙素、 氯化钾、甲醇、冰醋酸、吉姆萨染料、甘 油 谢谢！谢谢！ 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his ）菌株，在含微量组氨酸的培养基中， 除极少数自发回复突变的细胞外，一般只 能分裂几次，形成微菌落。 受诱变剂作用后，大量细菌发生回复突变， 自行合成组氨酸，发育成2倍以上阴性对照 的菌落数。 染毒 样品设计三个剂量，0.2g/ml 0.1g/ml 0.05g/ml 染毒过程分加S9混合物和不加S9混合物 秋水仙素处理，收细胞，制片 消化细胞后加含血清培养液，