紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化

1、园 艺 学 报 2014，41（6）：11051114 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140213；修回日期：20140506 基金项目：浙江省新品种选育重大科技专项（2012C12903）；浙江省农业科学院创新提升工程项目（2012R23Y01E01） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：maowh） 紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化 包崇来，杜黎明，胡天华，朱琴妹，胡海娇，毛伟海* （

2、浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021） 摘 要：建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。利用该方法，以获得茄子SmARF8基因RNA干涉转基因植株为目的，构建了以NPT基因为筛选标记的融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT，并通过农杆菌介导，侵染茄子下胚轴外植体。含有2 mg L-1吲哚乙酸，0.5 mg L-1玉米素，25 mg L-1卡那霉素和500 mg L-1头孢氨苄的MS选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分化苗，再生率达到80%。转基因苗继续生长并在不含激素的MS培养基上产生健壮根系，最终获得转基因株系。RT-PCR和qRT-PCR分

3、析验证了T0代转基因株系中内源基因SmARF8被干涉后不表达或表达量降低，Southern blot分析显示选择的T0代转基因株系中存在1个T-DNA插入拷贝。以上研究结果表明利用建立的转基因体系SmARF8基因在茄子中被成功敲除。 关键词：茄子；转基因；RNA干涉；农杆菌 中图分类号：S 641.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1105-10 Optimization of the Transgenic System and Genetic Transformation of SmARF8 Gene RNAi Vector in Red-purple Lon

4、g Eggplant BAO Chong-lai，DU Li-ming，HU Tian-hua，ZHU Qin-mei，HU Hai-jiao，and MAO Wei-hai * （The Institute of Vegetable，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China） Abstract：A high efficient genetic transformation system was developed using hypocotyl explants for producing transgen

5、ic red-purple long eggplant（Solanum melongena L.）. To generate SmARF8 gene RNAi transgenic eggplant plants，the binary vector pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT with the selectable marker gene neomycin phosphotransferase（NPT）was constructed and transformed into eggplant hypocotyl explants via Agrobacterium

6、 tumefaciens-mediated infection. Transgenic plantlets were induced on MS selective media containing 2 mg L-1 indole-3-acetic acid，0.5 mg L-1 zeatin，25 mg L-1 kanamycin and 500 mg L-1 cefotaxime with regeneration ratio higher to 80%. Subsequently，the transgenic plantlets kept growing on same medium a

7、nd then rooted efficiently on MS basic media to become transgenic plants. The RT-PCR and qRT-PCR analysis showed no or less transcript of SmARF8 in T0 transgenic generation. Further Southern blot analysis of selected T0 transgenic plants confirmed the presence of single T-DNA insertion. These result

8、s demonstrate that the endogenesis SmARF8 has been successfully knocked out in 1106 园 艺 学 报 41卷 eggplant using the established transgenic system in this study. Key words：eggplant；genetic transformation；RNA interference；Agrobacterium tumefaciens 茄子（Solanum melongena L.）极易受黄萎病和青枯病等多种病害以及各种昆虫的危害，虽然部分野生

9、种拥有天然抗性，但因连锁有害基因的存在，导致育性不兼容（Pratap et al.，2011）。随着分子生物学和基因工程的研究进展，可将各种重要调控基因转导到茄子中，快速改良品种（Mariashibu et al.，2012）。如Rotino等（1997）采用基因工程手段，利用生长素合成基因，获得单性结实茄子品种，并在番茄、草莓、悬钩子、葡萄上进行了推广应用（Rotino et al.，1997，2005；Ficcadenti et al.，1999；Mezzetti et al.，2004）。 目前茄子转基因已得到广泛研究。如以根为外植体，0.1 mg L-1 TDZ和3 mg L-1 6-

10、BA能通过愈伤组织诱导产生不定芽，但是该方法耗时较长（Franklin & Lakshmi，2003）；以子叶为外植体，2.5 mg L-1 6-BA和0.5 mg L-1 IAA能直接快速诱导产生再生苗，再生率达到60%（Prabhavathi et al.，2002）；Singh等（2010）以茎段为外植体，pPRV111A质体表达载体经基因枪轰击，成功获得转基因茄子；Subramanyam等（2013）以茄子种子为外植体，利用乙酰丁香酮和Silwett L-77的辅助侵染，真空导入pCAMBIA 1301-bar载体获得转基因苗。Singh等（2010）和Subramanyam等（201

11、3）创建的转基因方法，能大幅度缩短转导时间，且为茄子基因工程提供了新思路，但是需要配备特定的操作仪器，成本较高。虽然已有多种方法成功获得茄子转基因苗，但不同基因型材料的再生能力差异很大，影响再生的途径（金丹丹 等，2004），如对浙江省大面积种植的紫红线茄采用已公开发表的转基因方法，均不能成功获得转基因植株。 许多试验表明选择标记基因和GUS报告基因的启动子会影响临近启动子的表达能力和特异性（Yoo et al.，2005；Zheng et al.，2007）。目前已有许多研究人员意识到这种反馈抑制，并开展了关于如何增强多启动子调控的机制研究，期望能避免或者阻止这种不良影响（Singer et

12、 al.，2011）。且GUS报告基因和选择标记基因的存在不利于转基因植株在育种上的直接应用，消费者由于担心标记基因的副作用而不能完全接受。Darwish等（2014）利用pMAT21载体，以子叶为外植体，获得无抗性标记基因的转基因苗，可在育种中直接得到应用。 本试验中以紫红线茄为材料，针对其转基因过程中植物生长调节剂种类和浓度、选择压卡那霉素浓度进行了改良，创建了不含GUS报告基因的融合表达载体，期望能建立一个最有效、最适宜紫红线茄的转基因体系，为加速茄子育种建立理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料及其处理 选择浙江省大面积种植的紫红线茄品种亲本E666、E25、E22和E673等4个材

13、料进行转基因体系创建工作。 精选种子经75%乙醇处理30 s后，用10% NaClO表面消毒15 min，或0.1% HgCl2分别消毒1 min，2 min，无菌水洗涤5次。平铺到含3%蔗糖和200 mg L-1头孢氨苄（Cefotaxime，Cef）的MS固体培养基上，以不加Cef为对照。每瓶放置20粒种子，3次重复。在（30 1），黑暗中培养7 d后开始发芽，在光照300 mol m-2 s-1、28 /20 （16 h /8 h）的生长箱内继续培养7 d，培育出含有2片子叶的无菌小苗。 6期 包崇来等：紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化 1107 1.

14、2 载体构建 根据茄子生长素响应因子SmARF8基因（FJ597628）cDNA序列设计引物SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R（表1）（杜黎明 等，2009），以茄子叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。条件为：94 变性2 min；94 30 s，60 30 s，72 30 s，运行32次循环。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测（图1）。2个PCR扩增片段分别以35和53方向构建到PBS-in载体玉米NIR1基因第2个内含子350 bp片段两端后，用Sac和Pst进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的部分，命名为片段A。将CaMV 35S启动子亚克隆到pCAM

15、BIA1300载体（http：/ /daisy/cambia/materials/vectors.html）的EcoR和Sac酶切位点之间，豌豆Rubisco E9基因的poly（A）序列插入到载体Pst和Hind 酶切位点之间，成功获得pCAMBIAI 35S-1300载体。酶切后的片段A，用T4 DNA连接酶构建到Sac和Pst酶切后的pCAMBIAI 35S-1300载体上；将含有35S启动子、片段A和poly（A）终止子的载体pCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT经EcoR和Hind 酶切后，构建到经EcoR和Hind 酶切的pCAMBIA

16、I 35S-2300载体上，成为含有NPT抗性基因的复合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT。以SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R引物对构建好的载体进行测序验证（上海生工生物工程公司），EcoR和Hind 进行酶切鉴定。 表1 引物序列 Table 1 Primer sequences 名称 Name 序列（53） Sequence（53） 目的基因 Gene SmARF8-INT-F CAGTTTCAACATCAACAGCGAACC SmARF8 SmARF8-INT-R ACAAATGGAGTAACCCGAGAAG SmARF8-Q-F TTCC

17、CAGCAAACCTTTTCTGATATG SmARF8-Q-R CGCTTTGATGATGAGGACGAAGAC SmActin-F GCTAGTGGTCGTACAACTG SmActin SmActin-R CAGCAGTGGTGGTGAACATATAAC NPTII-F GAGGCTATTCGGCTATGACTG NPTII NPTII-R ATCGGGAGGGGCGATACCGTA 1.3 预培养 分化培养基选择附加不同浓度吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）和玉米素（Zeatin，ZT）的MS培养基（表2）。在超净台下将无菌苗的下胚轴切成0.5 cm长的片段，

18、切下带柄子叶，分别接种到各种浓度培养基上。25 ，16 h光照/8 h黑暗，50 mol m-2 s-1光照强度的生长室内预培养生长2 d。 1.4 农杆菌侵染和共培养 将融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT经电击转化转入农杆菌EH105菌株中，挑取单菌落，在含有50 mg L-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）和链霉素的5 mL YEP液体培养基中28 震荡培养过夜，再倒入50 mL YEP继续培养5 h，直到OD值为0.4 0.7。菌液700 g离心5 min后，去除上清液，沉淀用等体积MS液体培养基重新悬浮。无菌外植体预培养2 d后，在农杆菌悬浮液中

19、浸润5 min，在无菌滤纸上沥干，然后重置回预培养瓶中继续培养2 d。 1.5 分化与生根培养 农杆菌侵染后，外植体在预培养基上共培养2 d后，转移到分别添加有100、50、25 mg L-1 Kan1108 园 艺 学 报 41卷 和500 mg L-1 Cef的MS选择培养基上（植物生长调节剂浓度同预培养基）继续生长，直到获得不定芽，统计出芽率（长出不定芽的外植体占总数的百分比）。分化苗延伸生长后转移到不含植物生长调节剂的MS选择培养基上进行生根培养。生根后转移到含有营养土的塑料钵中，在温室中进行生长，直至开花结果，收集种子。 1.6 转基因茄子的RT-PCR和qRT-PCR分析验证 为了

20、检测转基因苗的基因干涉效果，用半定量RT-PCR分析检测SmARF8基因的转录表达情况。利用RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），将转基因及对照非转基因苗的叶片组织，提取总RNA后，用SuperScript Transcriptase （上海生工生物工程公司）逆转录成第一链cDNA。以干涉载体构建引物SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R（表1）进行PCR检测，以茄子SmActin为参考基因，设计引物SmActin-F和SmActin-R（表1）。PCR扩增条件为：94 变性2 min；94 30 s，60 30 s，72 30 s，运行28次循环。PCR产物用1.2%琼脂糖凝

21、胶电泳进行检测。 根据SmARF8基因序列设计引物SmARF8-Q-F和SmARF8-Q-R（表1），进行荧光实时定量qRT-PCR分析验证。同样以SmActin为参考基因。根据RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒（天根生化科技有限公司），ABI Prism STEP-ONE PLUS real-time thermal cycler仪器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）进行qRT-PCR分析。94 变性10 min；94 20 s，60 60 s，运行40次循环，同时进行溶解曲线分析，确保PCR产物唯一性。3次重复。 1.7 转基因茄

22、子Southern blot分析验证 为了进行Southern blot分析转基因植株的拷贝数，根据CTAB法以及改良的茄子DNA提取体系（杜黎明 等，2007），分别从转基因与非转基因植株新鲜叶片中提取基因组DNA。10 g DNA通过限制性内切酶EcoR酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后转移到Hybond尼龙膜上。根据载体上的抗性基因NPT序列设计引物NPT-F和NPT-R（表1），获得700 bp PCR片段为探针，-32P（New England Biolabs）进行同位素标记，根据Sambrook等（1989）的方法进行杂交。室温下将膜分别用2 SSC + 0.1% SDS和1 SSC

23、+ 0.2% SDS冲洗，65 下分别在0.5 SSC + 0.1% SDS和0.1 SSC + 0.1% SDS中漂洗30 min，晾干后分析。 2 结果与分析 2.1 消毒方法的确立 0.1% HgCl2处理的种子，播种在不含Cef的MS固体培养基上生长发芽结果显示，处理2 min的种子不会污染，但是发芽率只有10%；而处理1 min的种子污染率为50%，发芽率也只有50%。因此，HgCl2消毒方式不适合茄子无菌苗的培养。 10% NaClO消毒15 min的种子，播种在不含Cef的MS固体培养基上，污染率为30%，但是发芽率达到80% 90%。MS固体培养基中加入200 mg L-1 C

24、ef后，不会出现污染，发芽率也没有受影响，能达到90%左右。因此最后选择10% NaClO消毒15 min，在含200 mg L-1 Cef的MS固体培养基上培养无菌苗。 2.2 融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT的构建 以SmARF8-INT为引物的PCR克隆扩增获得294 bp片段，产物位于SmARF8基因1 609 1 902 bp区段。首先将PCR扩增片段构建到含有内含子结构的PBS-in载体上，以至于当这个片段转导到6期 包崇来等：紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化 1109 植物体内时能形成发夹结构，从而达到干涉内

25、源基因，使它们不能进行转录表达的目的。 为了构建不含GUS报告基因的转导载体，选择pCAMBIAI 35S-2300载体，但是该载体不含有可以利用的35S启动子终止子序列。所以首先将可以形成发夹结构的片段A构建到含有35S启动子终止子的pCAMBIAI 35S-1300载体上，产生35S启动子片段A终止子的完整结构，再将该部分酶切连接到pCAMBIAI 35S-2300载体上，从而获得融合表达载体pCAMBIAI 35S- 2300-SmARF8-INT（图1）。 EcoR和Hind 酶切鉴定结果显示有约2 500 bp的条带从载体上切除下来，表示载体构建成功（图2），并经测序进一步验证了插入

26、片段序列。 图1 载体构建过程框架图 A：含有玉米NIR1基因第2个内含子的PBS-in载体，SmARF8基因片段分别以相反方向构建到内含子区域两端，被命名为片段A； B：PCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT载体T-DNA区域；C：PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT载体T-DNA区域。 Fig. 1 Schematic representation of the vector A：The PBS-in vector with No. 2 introns of maize NIR1，in which the SmARF8 PCR fragments ar

27、e located in two sides of introns as reverse direction and the fragment was named A；B：The T-DNA region of PCAMBIAI 35S-1300-SmARF8-INT vector； C：The T-DNA region of PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT vector. 图2 PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT载体EcoR和Hind 酶切鉴定 2 500 bp条带为酶切后的插入片段。 Fig. 2 The vector PCAMBIAI 35

28、S-2300-SmARF8-INT was digested by EcoRand Hind The 2 500 bp band is the insert fragment. 1110 园 艺 学 报 41卷 2.3 选择培养基条件筛选及转基因苗的产生 融合表达载体pCAMBIA35S-2300-SmARF8-INT带有Kan报告基因，因此选择培养基中须加入合适浓度的Kan，并加入Cef抗生素以抑制农杆菌。 紫红线茄材料E666无菌苗的下胚轴和带柄子叶外植体经农杆菌侵染后转移到含不同浓度ZT，IAA，25、50和100 mg L-1Kan及500 mg L-1 Cef的选择培养基上生长，结果

29、发现当Kan浓度为100和50 mg L-1时，外植体生长7 d后就会开始褐化直到死亡；当Kan浓度降低到25 mg L-1时，外植体生长良好，因此表明25 mg L-1 Kan浓度为较合适选择压。 在不同浓度ZT、IAA组合和25 mg L-1 Kan及500 mg L-1 Cef的选择培养基（表2）上，E666无菌苗的下胚轴外植体生长情况有所区别，在8号培养基上生长情况最佳，大部分下胚轴能未经愈伤组织分化而直接长出不定芽，出芽率达到80%（图3，A、B；表2）；7号和9号培养基出芽率分别为32%和33.3%；其他的都低于30%，甚至为0。带柄子叶外植体在各选择培养基上均没有长出不定芽，且在

30、培养基上生长7 d后开始呈现褐化，最后死亡。 其他3种材料E25、E22和E673的培养结果与E666相似，下胚轴外植体能在8号培养基上诱导产生不定芽，出芽率为60% 80%，而带柄子叶外植体都在选择培养基上褐化直至死亡。 终上所述，紫红线茄下胚轴外植体，较适宜的选择培养基为2.0 mg L-1 ZT + 0.5 mg L-1 IAA + 25 mg L-1 Kan + 500 mg L-1 Cef的MS培养基，可以作为其转基因体系。 利用该优化转基因体系，一共获得80株分化苗。分化苗长到适宜大小后，尽量切除干净外植体，转移到玻璃瓶中，在同样的MS选择培养基上继续延伸生长。28 d后，转基因苗

31、在不加任何激素，含25 mg L-1 Kan和500 mg L-1 Cef的MS培养基上进行生根培养，能产生健壮根系，成功获得完整植株。最后将50株有完整根系且发育良好的植株转移到含有营养土的塑料钵中，在玻璃温室中继续生长（图3，C F），以便收集种子。 表2 分化培养基中玉米素和吲哚乙酸的浓度配比及分化效率 Table 2 The concentration of ZT and IAA on differential medium and the efficiency of buds induction 名称 Code ZT/ （mg L-1） IAA/ （mg L-1） 出芽的下胚轴数 B

32、uds induction 不能出芽的下胚轴数 No buds development 出芽率/% Ratio 1 2.5 0.1 5 50 9.1 2 2.5 0.3 10 60 14.3 3 2.5 0.5 8 40 16.7 4 2.5 0.8 28 110 20.2 5 2.5 1.0 2 80 2.0 6 2.0 0.1 6 45 11.7 7 2.0 0.3 36 76 32.0 8 2.0 0.5 40 10 80.0 9 2.0 0.8 14 28 33.3 10 2.0 1.0 10 40 20.0 11 1.5 0.1 5 60 7.6 12 1.5 0.3 15 45 2

33、5.0 13 1.5 0.5 16 38 29.6 14 1.5 0.8 10 49 16.9 15 1.5 1.0 6 56 9.6 注：基本培养基为MS + 25 mg L-1 Kan + 500 mg L-1 Cef。 Note：The basic medium is MS with 25 mg L-1 Kan and 500 mg L-1 Cef. 6期 包崇来等：紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化 1111 图3 含有PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT载体的转基因茄子发育过程 A、B：下胚轴外植体在2.0 mg L-1 ZT +

34、 0.5 mg L-1 IAA + 25 mg L-1 Kan + 500 mg L-1 Cef的MS选择培养基上培养 21 d和28 d；C：分化苗在选择培养基上继续伸长；D：分化苗在含有25 mg L-1 Kan和 500 mg L-1 Cef的MS培养基上生根；E：转基因植株转移到塑料钵中生长； F：植株在温室中生长结果。 Fig. 3 Development of transgenic eggplants var pCAMBIA-35S-2300-SmARF8-INT A，B：Hypocotyl explants grew on MS selective medium suppleme

35、nted with 2.0 mg L-1 ZT，0.5 mg L-1 IAA，25 mg L-1 Kan and 500 mg L-1 Cef for 21 and 28 days；C：Elongated Kan-resistant shoots on selective medium； D：Kan-resistant shoots rooting on basal MS medium containing 25 mg L-1 Kan and 500 mg L-1 Cef； E：Transgenic plant transferred to a plastic pot and farmyard

36、 manure after rooting； F：Mature transgenic plant bearing fruits. 2.4 分子验证分析 为了分析验证转基因植株的SmARF8基因RNA干涉效果，随机选择20株发育良好、生长健壮及外形正常的假定转基因苗和非转基因苗，提取叶片组织总RNA，逆转录成第一链cDNA后进行PCR分析。RT-PCR结果显示，以SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R为引物，在对照非转基因植株中通过PCR扩增能获得约300 bp大小的清晰条带，表明内源基因SmARF8显著表达。有15株转基因植株中SmARF8表达量显著降低，图4为其中5株转基因植株P

37、CR产物电泳结果，显示基因SmARF8在株系4中微弱表达，而在株系6中几乎不表达，结果说明15株转基因植株已成功导入载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT，并且RNA干涉效果较良好，以至于内源基因SmARF8表达量显著降低或几乎不表达。 荧光定量qRT-PCR分析（图5）进一步验证了该结果。以非转基因株系中的表达量作对照，尤其是株系4和株系6几乎不表达。5个株系的SmARF8基因表达量显著降低。 为了进一步验证分析转基因植株插入基因的拷贝数，使用植株基因组DNA进行Southern blot分析。经RT-PCR和qRT-PCR分析验证的5株转基因和1株非转基因植株DNA，

38、EcoR 酶切后，以同位素32P标记过的NPT基因为探针进行杂交。结果显示转基因株系中有1个条带（图6），表1112 园 艺 学 报 41卷 图5 非转基因对照和转基因植株（T0）的qRT-PCR分析 qRT-PCR分析鉴定SmARF8基因的mRNA转录表达水平， SmActin基因作为对照基因。1：非转基因对照植株； 2 6：转基因植株。 Fig. 5 qRT-PCR of non-transgenic control and transgenic eggplants（T0） qRT-PCR was performed to examine the SmARF8 gene mRNA tran

39、script. 1：Non-transgenic control plants； 26：Transgenic eggplants. 图6 非转基因对照和转基因植株（T0）的Sourthern blot分析 RT-PCR验证过的转基因植株Southern blot杂交分析。 1：非转基因对照植株；2 6：转基因植株。 Fig. 6 Southern blot ananalysis of non-transgenic control and transgenic eggplants（T0） Southern blot hybridization analysis of RT-PCR positiv

40、e transgenic plants. 1：Non-transgenic control plants； 26：Transgenic plants. 明它们含有一个T-DNA插入拷贝，而非转基因株系中没有条带，说明没有T-DNA插入拷贝存在。将这5株转基因株系在温室中培养，果实成熟后收集种子，继续播种生长获得T1代植株，做进一步的表型分析研究。 图4 非转基因对照和转基因植株（T0）的RT-PCR分析 RT-PCR分析鉴定SmARF8基因的mRNA转录表达水平，SmActin基因作为参考基因。 M：DNA marker；1：非转基因对照植株；2 6：转基因植株。 Fig. 4 RT-PCR

41、ananalysis of non-transgenic control and transgenic eggplants（T0） RT-PCR was performed to examine the SmARF8 gene mRNA transcript. M：DNA marker；1：Non-transgenic control plants； 26：Transgenic eggplants. 3 讨论 茄子作为一种重要经济作物，转基因研究非常重要，如果能充分利用高效的转基因体系，可以将一些重要而优良的农艺性状调控基因转导到茄子中，从而可以快速改良品种。因此结合本地育种目标，创建适合本地

42、品种的转基因体系非常重要。 6期 包崇来等：紫红线茄转基因体系优化及SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化 1113 紫红线茄用目前已经发表的大部分转基因方法，都不能非常有效地获得分化苗，因此需要对转基因方法进行改良，创建适合紫红线茄的转基因体系。作者前期曾利用添加有6-BA、ZT、反式ZT、IAA及NAA等多种植物生长调节剂不同浓度组合的MS培养基进行分化培养预试验，发现ZT和IAA组合下外植体生长最好，将该组合进行不同浓度梯度试验，结果发现当MS培养基中IAA浓度为0.3 0.5 mg L-1，ZT浓度为2.5 1.5 mg L-1时，都能有效获得分化苗。而当IAA浓度过低或过高时，

43、外植体都会迅速褐化死亡，因此IAA的浓度对转基因体系有着关键的调控作用。已公开的转基因体系可以采用100 mg L-1的Kan为选择压（Franklin & Lakshmi，2003），而在本方法中仅采用25 mg L-1的Kan为选择压，表明紫红线茄对Kan的抵抗性较弱。 根据当前研究基础，发现大部分茄子转基因方法采用根或子叶为外植体。但是当紫红线茄以带柄子叶为外植体时，应用已公布的转基因体系（Prabhavathi et al.，2002；Franklin & Lakshmi，2003；Singh et al.，2010；Subramanyam et al.，2013）和本试验中各种植物生

44、长调节剂浓度组合的培养基，都不能产生分化苗，这个结果表明紫红线茄不适合以带柄子叶为外植体。Singh等（2010）以茎为外植体，利用基因枪轰击方法获得茄子转基因苗，但是再生率低于50% 55%。本研究体系中，以下胚轴为外植体，分化苗再生率能达到80%，且不用产生愈伤组织而直接产生不定芽，大幅度提高了茄子转基因效率，缩短了培养时间。 转导载体中报告基因的存在，虽然有利于转基因苗的筛选，但是由于消费者担心报告基因的副作用而不能充分接受，因此妨碍育种的应用进程。转基因植物的选择标记去除工作是植物生物学研究的重要研究目标，无标记基因的转基因植株，更容易被消费者接受，且能消除对环境的不良影响（Rosel

45、lini，2012）。孙磊等（2008）利用双T-DNA超级双元载体pCAMB IA1300-gus，通过共转化方法创建获得无选择标记基因的转基因菊花，大大改良了菊花转基因体系。本试验结果表明，pCAMBIAI 35S-2300载体经改造后，尽管没有GUS报告基因辅助筛选转基因苗，但是在随机选择的20株分化苗中，经RT-PCR和qRT-PCR检测后，其中15株被成功导入外源载体，并达到较好的RNA干涉效果，转基因植株所占比例达到75%。因此本研究体系能有效使用不含报告基因的载体，有利于转基因材料在育种中的直接应用。 References Darwish N A，Khan R S，Ntui V

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