实验二---PCR和分子标记技术及其应用[1]

1、PCRPCR和分子标记技术及其应用和分子标记技术及其应用 实验二实验二 2008.10.23 DNADNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。 传统标记：形态标记、细胞学标记、生化标记传统标记：形态标记、细胞学标记、生化标记 分子标记分子标记 万变不离其宗：分子杂交、万变不离其宗：分子杂交、PCRPCR扩增扩增 第一代：电泳、分子杂交为核心第一代：电泳、分子杂交为核心 代表：代表：RFLPRFLP、DNADNA指纹指纹 第二代：电泳、第二代：电泳、PCRPCR为核心为核心 代表：代表：RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFL

2、P 第三代：第三代：DNADNA序列为核心序列为核心 代表：代表：SNPSNP 优点优点 数量丰富、信息量大； 与生长发育无关，取材不受限制； 较多共显性，信息量完整 在真核生物中，基因组DNA多态性要远 远多于各种基因的遗传多态性，因为基 因组中存在着大量的不编码的DNA序列， 它们的变异不受或较少地受自然选择的 制约 应用应用 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 第一代分子标记技术第一代分子标记技术 RFLPRFLP、DNADNA指纹指纹 RFLP(RRFLP

3、(Restriction estriction F Fragment ragment L Length ength P Polymorphism)olymorphism) by Botstein(1980) 基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下， 产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记 的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来， 从而构建出多态性图谱。 优点：共显性，非常稳定 缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱； 用作探针的DNA克隆制备、保存不方便； 放射性同位素 自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、 大豆、小麦、水稻等各种生物的RFLP图谱。

4、0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb 0.3kb0.4kb0.5kb (1) (2) 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系品系1 品系品系2 0.4kb 0.1kb + 第二代分子标记第二代分子标记 RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP 第二代分子标记主要以电泳和第二代分子标记主要以电泳和PCR技术为核心技术为核心 RAPD 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA SSR 微卫星微卫星DNA AFLP 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 CAPs 酶切扩增多态性序列酶切扩增多态性序列 ISSR 简单序列重复区间简单序列重复区间 STS 序列标签位点序列标签位点 SCAR 序列

5、特异性扩增区域序列特异性扩增区域 SRAP TRAP RAPD-RFLP 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCRPCR( (P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction)eaction) 主要通过三个步骤来完成：主要通过三个步骤来完成： 1. 1. DNADNA变性变性, , 95 step to denature the duplex DNA， 2. 2. 退火与引物的结合退火与引物的结合, , An annealing step of around 55 to allow the primers to bind， 3. 3. 聚合酶催化下的聚合

6、酶催化下的PCRPCR链延伸链延伸, , 72 polymerization step. . 原理原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加 热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这 一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升 高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种 热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是 在合适条件下的这种循环的不断重复。 60s-70s：当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物 Kary Mullis(1985) 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不 耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费 力、易出错。耐热DN

7、A聚合酶的应用使得自动化。 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 分离分离: : 19691969年，美国黄石国家公园温泉年，美国黄石国家公园温泉 分子量分子量: :94KDa94KDa 活性活性：在几种水生栖热菌中活性最高，：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg200000U/mg 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为 50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为 210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其 他化学药剂。 内源DNA:不同来源的

8、酶可能由于制备过程中残留的原细菌 DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩 增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。 保存:在-20至少6个月。 proceduresprocedures template(DNA or template(DNA or RNA),RNA), primers,primers, Taq enzyme,Taq enzyme, 1010PCR buffer,PCR buffer, MgMg+, +, 5mmol/L dNTPs5mmol/L dNTPs pre-denaturationpre-denaturation- - denature

9、completelydenature completely DenaturationDenaturation annealingannealing ElongationElongation cycles:25-30cycles:25-30 RAPDRAPD(R(Randomandom A Amplifiedmplified P Polymorphismolymorphism D DNA) NA) 随机扩增多态随机扩增多态 性性DNADNA 1990:1990: Williams(Du Pont)Williams(Du Pont)：RAPD;RAPD; Welsh(Cal.Biology Ins

10、t.)Welsh(Cal.Biology Inst.)：AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR) AP-PCR(Arbitrary Primer-PCR) =Random Primer-PCR=Random Primer-PCR =Oligo Primer-PCR=Oligo Primer-PCR =SODA(Small Oligo DNA Analysis=SODA(Small Oligo DNA Analysis） Rapid and simpleRapid and simple Random primer:9-10bpRandom primer:9-10bp 0.2kb

11、0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系品系1 品系品系2 A.A.引物长度短引物长度短 常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个 引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。 B.B.退火温度低退火温度低 RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37。 C.C.通用性通用性 实验步骤少，省工、省力、进度快; 不需先知道基因组的任何分 子信息; 所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位 的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可 使用; 引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一

12、种植 物的研究，具有广泛性和通用性。 缺点：（1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 （2）对反应条件敏感，重复性差。包括模板浓度、Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 （3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段不 一定同源；一条带可能包含不同的产物。 AFLPAFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism) 瑞士Zabeau等1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可 靠性和PCR技术高效性。 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接 头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进 行选择性扩

13、增。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内 切酶以达选择的目的。 在不需要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单 个反应中检测到大量的片段。 技术路线 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高， 需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4-6的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 特点 -理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数 目很多，所以标记数目是无限的。 -每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用 -呈典型的孟德尔方式遗传 -可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。 -可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段， 对

14、模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强 度一致的谱带。 缺点 -专利技术，试剂盒价格贵 -需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配 套仪器设备 -基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯 度和内切酶的质量要求较高。 SSRSSR （S Simple imple S Sequence equence R Repeatepeat） SSR：简单重复序列多态性，也叫微卫星标记。 微卫星：即短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)，它是由2- 6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片段长度在100- 300bp。由于微卫星DNA具有高度的多态性和

15、遗传稳定性，所 以非常适合作为遗传学DNA分子标记， 广泛分布于真核生物基因组中，以人类基因组为例，平均每 15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约 有50,000-100,000个STR位点。常见的微卫星如TGTG TG= (TG)n或AATAATAAT= (AAT)n等，不同数目的核心序列 呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。 在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因 型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位 两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键 是首先要了解SSR座位的侧翼序列，寻找其中的特异保守区。 微卫星的优点

16、：微卫星的优点： （1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。据估计，在 基因组中平均3050kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中 定位更多的基因提供了极大的方便 （2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星是共显性标 记，位点检测可以显示纯合子和杂合子。 （3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动 化分析。通过GeneScan检测，一个位点的检测一般可在24h内完 成，且可同时进行多位点的检测。 缺点：缺点：要了解SSR座位的侧翼序列，必须进行大量的测序工作 Genome SSR EST-SSR ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)ISSR

17、 (Inter-Simple Sequence Repeat) ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年在微 卫星基础上发展起来的一种新的分子标记。其基本原理是:用 锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3端或5端加 上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位 点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA片段进行PCR扩增。所扩增的两个SSR区域之间的多个 条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性 表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰 富，因而可以检测到高的多态性。

18、 ISSRISSR分子标记的特点分子标记的特点 优点：优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点,所需DNA模板的量 少、多态性丰富, 无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、 操作简单、稳定性较高、呈孟德尔式遗传 缺点：缺点：是PCR 扩增时最适反应条件需要一定时间摸索, 其标记 大多为显性标记, 在解决交配系统、计算杂合度和父系分析 等问题时效果不佳 引物设计是 ISSR技术中最关键、最重要的一步。基因组中SSR 一般为 26个寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常为 5或 3端 加锚定的二核苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重复序列，重复次 数 一般为48 次，使引物的总长度达到 1618bp

19、 。 5或 3 端用于锚定的碱基数目一般为 14个，锚定的目的是引起特定 位点退火， 使引物与相匹配 SSR的一端而不是中间结合，从而 对基因组中特定片段进行扩增、检测。由于植物基因组中SSR 最多的 是 (AT) n、(TA) n、(GA) n 、(CT) n等二核苷酸重复序列 ， 在选择 ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚 三核苷酸、四核苷酸引物。 染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一 份拷贝的DNA短片断，一般长200500bp。STS 标记是根据单拷 贝的DNA片断两端的序列，设计一对特异引物，经PCR扩增基因 组DNA而产生的一段长度为几百bp的特

20、异序列。 STSSTS（sequence-tagged sitesequence-tagged site）序列标定位置）序列标定位置 前述任何单拷贝的多态性标记都可以作为基因组的界标转变为 STS, 转变的前提是测定长度适合的单拷贝片段的两端序列, 设计 一对专一扩增的引物(长度为20个bp左右) , 用PCR方法显示STS的 特异片段。STS标记的优点在于其共显性遗传方式, 因而很容易 在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移, 在基因组作图上具有 非常重要的作用, 在人类的基因组作图中已被用作遗传图谱与物 理图谱整合的共同位标, STS 的开发也依赖于测序, 但一旦开拓, 同行受益。 SRAP

21、(Sequence-Related Amplified Polymorphism)是一种基于PCR 技术的新型分子标记, 具有简便、产率中等、稳定、测序方便 等优点。它利用独特的引物设计对ORFs( open reading frames) 进行扩增, 其上游引物长17bp, 下游引物长18bp, 分别对外显子 和内含子进行扩增, 因个体不同及内含子、启动子与间隔长度 不等而产生多态性。 SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism) 该技术针对基因外显子富含GC，内含子富含AT的特点，进行 特殊的引物设计。其中，上游引物对外显子进行特异扩增， 下游

22、引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。 SRAP 引物可以通用，但不同的引物组合对扩增多态性影响 很大。 靶位区域扩增多态性(TRAP)也是一种新型的基于PCR的分子标 记。TRAP标记技术是基于SRAP发展而来的,但与SRAP、RAPD 和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同,它 是基于已知的cDNA 或EST序列信息。TRAP是使用长度为16-20 核苷的固定引物( fixed primer)与任意引物( arbitrary primer), 固定 引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来;任意引物与SRAP所 用的一样,为一段以富含AT或GC为核心、可与内含子或外

23、显子 区配对的随机序列。 TRAP( target region amplified polymorphism) TRAP( target region amplified polymorphism) 靶位区域扩增多态性靶位区域扩增多态性 引物的设计易于操作, 固定引物的设计依据已有的EST数据库; 而随机引物只需考虑具有富含GC或AT的核心区, 其余均为随机 序列。 TRAP标记技术在大多数情况下, 可在一个PCR反应中扩增出多 达50个以上的可统计片段, 片段大小在50-900bp 之间, 产生出与 AFLP技术相媲美的图谱。 单核苷酸多态性( single nucleotide poly

24、morphisms,SNPs)是指染色 体基因组水平上某个特定位置单碱基的置换或插入缺失引起的 DNA 序列多态性。其中,单碱基的置换是其最为常见的类型。 SNP被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记。 SNP( single nucleotide polymorph ism ) SNP( single nucleotide polymorph ism ) 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 (1) SNP 数量多,分布广泛,密度高。SNP是目前为止分布最为广 泛、存在数量最多的一种遗传多态性。 (2)代表性。某些位于基因内部的SNPs有可能直接影响蛋白质 结构或表达水平,因此它们可能代

25、表疾病遗传机理中的某些作 用因素; (3)遗传稳定性。SNP是基于单核苷酸的突变,所以其突变率低, 一般仅为10-9, 具有更高的遗传稳定性; (4)易实现分析的自动化。SNP标记大多数只有两种等位基因 型,所以也被称为双等位基因标记。 标记系统在应用时的选择标记系统在应用时的选择 RFLPRFLPRAPDRAPDAFLPAFLPSSRSSRSNPSNP 遗传特性遗传特性共显性共显性显性显性显性显性/ /共共 显性显性 显性显性显性显性/ /共显共显 性性 多态性多态性低低中等中等高高高高低低 检测基础检测基础分子杂交分子杂交随机随机RCPRCP专一专一PCRPCR专一专一PCRPCR专一专一

26、PCRPCR 检测基因组检测基因组 部位部位 单单/ /低拷贝低拷贝整个基因整个基因 组组 整个基因整个基因 组组 重复序列重复序列 区区 整个基因组整个基因组 技术难度技术难度难难易易易易易易易易 DNADNA质量质量高高低低高高低低低低 DNADNA用量用量510g510g50ng50ng50ng50ng50ng50ng50ng50ng 使用同位素使用同位素是是否否是是/ /否否否否否否 探针探针DNADNA短片段短片段 随机引物随机引物专一引物专一引物专一引物专一引物专一引物专一引物 费用费用中等中等低低高高高高高高 PCR optimizationPCR optimization 变性

27、温度和时间 92-95，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间 过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应 提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、 1-2分钟。 延伸温度和时间 温度：72，接近Taq酶的最适75 时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目 的序列，则可适当增加时间。 循环次数 循环过多，非特异性产物大量增加 PCRPCR常见问题、原因分析及其对策常见问题、原因分析及其对策 DNA DNA模板模板 引物引物 反应缓冲液反应缓冲液 dNTPdNTP ddH ddH2 2O O 耐热聚合酶耐热聚合酶 反应体系对

28、反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响 DNADNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCRPCR反应反应 完整性完整性 模板降解会导致模板降解会导致PCRPCR扩增无产物扩增无产物 浓度浓度 加量过多导致非特异性扩增增加加量过多导致非特异性扩增增加 特异性特异性 长度适当长度适当、避免二级结构和二聚体避免二级结构和二聚体 完整性完整性 避免反复冻融避免反复冻融 浓度浓度 应适当应适当, ,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加, ,过低则过低则 引引 物物 扩增产物太少扩增产物太少 反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响 反应反应

29、pHpH值值, ,盐离子浓度盐离子浓度 稳定剂稳定剂, ,增强剂增强剂 Mg Mg 2 2 浓度 浓度 过高非特异性严重过高非特异性严重 过低无扩增产物过低无扩增产物 浓度适当浓度适当 避免反复冻融避免反复冻融 ddH2OddH2O pHpH值适当值适当 避免污染避免污染 无扩增产物无扩增产物 1. 1.模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 2. 2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适 3. 3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降 解解 4. 4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延 伸时间太短伸时间太短 原原 因因 对对 策策 1. 1.

30、纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取 模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量 2. 2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度 3. 3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一 管新引物管新引物 4. 4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间 现象：现象：正对照有条带，而样品则无；正对照有条带，而样品则无； 非特异性扩增非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增