分析方法验证课件

1、JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *1 药品检验工作的基本程序药品检验工作的基本程序 取样取样鉴别鉴别检查检查 含量测定含量测定 写出检验报告写出检验报告 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *2 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *3 一、概述一、概述 含卤素药物 CXCX 乙烯型卤和芳卤 CH2CH XX 烯丙型卤和苄卤 CH2XCH2CH CH2X 卤代烷型CH2CH (CH2)nX n2 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF L

2、IFE SCIENCE *4 CCH3 OH CH3 CCl3 CCl3Cl3C 三氯叔丁醇 六氯对二甲苯 COOH II I NHCOCH3CH3CONH 泛影酸 COOH II I CONHCH3CH3CONH 碘他拉酸 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *5 不经有机 破坏 经有机破 坏 直接测定 配位滴定法 氧化还原滴定法 水解后测定 碱水解 酸水解 经还原分解后测定 湿法破坏凯氏定氮法 干法破坏 高温灼烧法 氧瓶燃烧法 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *6 ( (一一) )、直接测定法、

3、直接测定法 葡萄糖酸钙葡萄糖酸钙 EDTAEDTA配位滴定配位滴定 富马酸亚铁富马酸亚铁 邻二氮菲邻二氮菲- -硫酸铈滴定硫酸铈滴定 葡萄酸锑钠葡萄酸锑钠 间接碘量法间接碘量法 ( (二二) )、经水解后测定法、经水解后测定法 适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C- M键结合不牢固的有机金属药物。 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *7 1 1、碱水解法、碱水解法 3443 3 233 4)( NONHAgSCNSCNNHAgNO NaNOAgClAgNONaCl O2HHCOONa3NaClCO)(CHNaOHOHCHCCCl 3 22

4、3 回回流流 三氯叔丁醇 银量法 返滴定 2 2、酸水解法、酸水解法 适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不 牢固的药物。 十一烯酸氯化锌十一烯酸锌 稀盐酸 EDTA配位滴定 8 ( (三三) )、经还原分解后测定法、经还原分解后测定法 适用范围：碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。 COOH I I I NHCOCH3CH3COHN + 11NaOH+ COOH NH2 H2N + + 2CH3COONa +3Na2ZnO2 + NaI+AgNO3 AgI 3Zn 3 NaOH 3H2O + NaNO3 回流 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIE

5、NCE *9 三、经有机破坏的分析方法三、经有机破坏的分析方法 含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合 成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物 基质的去除。 u H H2 2SOSO4 4-HNO-HNO3 3 u H H2 2SOSO4 4-HClO-HClO4 4 u H H2 2SOSO4 4-H-H2 2SOSO4 4 u HNO HNO3 3-KMnO-KMnO4 4 分解剂/消化剂 辅助分解剂 凯氏定氮法 测定含有氨基和酰胺结测定含有氨基和酰胺结 构的药物结构构的药物结构 ( (一一) )湿法破坏湿法破坏 10 凯氏烧瓶 K2SO4( (提高消解温度提高消解温度)

6、 ) CuSO4( (加快消解速度加快消解速度) ) 硫酸硫酸 碱液碱液 硼酸硼酸( (吸收液吸收液) ) 甲基红甲基红- -溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂 硫酸滴定 空白校正 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *11 ( (二二) )干法破坏干法破坏 1.高温灼烧法高温灼烧法 用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。 常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。 2.氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭 的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分的密闭的燃

7、烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分 解为解为COCO2 2和和H H2 2O O，待测元素根据电负性的不同转化为不，待测元素根据电负性的不同转化为不 同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据 其性质和存在方式选择方法进行分析。其性质和存在方式选择方法进行分析。 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *12 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *13 有机药物 含P 吸收液测定方法 茜素氟蓝分光光度法(pH 4.3 HAc-NaAc Buffer) H2

8、O 含F 含Br银量法；分光法 银量法；汞量法；分光法NaOH溶液含Cl 磷钼蓝比色法 银量法；碘量法；汞量 法；分光法 NaOH-硫酸肼饱和液含I H2O2NaOH溶液 NaOH-硫酸肼饱和液 H2O 14 一、容量分析方法一、容量分析方法 1.滴定度滴定度 每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度。 dDcCbBaA 被测药物被测药物 滴定液滴定液 ABA B B A M b a nM bM W W ABB M b a Vm 15 M b a m)ml/mg(T %100 W FTV (%) 含量 规定摩尔浓度 实际摩尔浓度 F %100 W FT)VV( (%) 0 含量 JILIN

9、 UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *16 二、光谱分析法二、光谱分析法 ( (一一) )紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 ECL T l lgA u 仪器校正 u 空白溶剂校正 u 吸收峰波长确定 u A(0.30.7) JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *17 含量测定方法 1.对照品比较法 R R x x C A A C %100%100(%) W DC X 称样量 测得量 含量 原料药 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *18 2.吸收系数法 1

10、00E A C %1 cm1 x x 习题一 维生素B2含量测定 取本品取本品75mg，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1ml与与 水水75ml，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置500ml量量 瓶中，加水稀释至刻度，混匀；精密量取瓶中，加水稀释至刻度，混匀；精密量取10ml，置，置 100ml量瓶中，加量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液醋酸钠溶液7ml，并用水稀释至刻，并用水稀释至刻 度，摇匀，照分光光度法在度，摇匀，照分光光度法在444nm的波长处测吸收度，的波长处测吸收度， 按维生素按维生素B2B2的吸收系数的吸收系数 为为323计算计

11、算 1% 1cm E JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *19 3.计算分光光度法 4.比色法 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *20 特点： 灵敏度高，可达灵敏度高，可达1010-10 -10 1010-12 -12g/ml g/ml 要求低浓度下测定要求低浓度下测定 须做空白测定须做空白测定 荧光弱的药物可衍生化后测定荧光弱的药物可衍生化后测定 ( (二二) )荧光分析法荧光分析法 r b rr xbx x C RR RR C JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE

12、SCIENCE *21 ( (三三) )色谱分析法色谱分析法 1.HPLC 示例一 炔诺酮的含量测定 照高效液相色谱法照高效液相色谱法( (附录附录DD测定测定) ) 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为用十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂；以甲醇填充剂；以甲醇- -水水(65:35)(65:35)为流动相，检测波长为为流动相，检测波长为244nm244nm。理论。理论 塔板数按炔诺酮峰计算不低于塔板数按炔诺酮峰计算不低于15001500，炔诺酮峰与内标物质峰的，炔诺酮峰与内标物质峰的 分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要分离度及主成分峰后一

13、杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要 求。求。 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *22 测定法测定法 取本品约取本品约25mg25mg，精密称定，置，精密称定，置25ml25ml量瓶中，加甲醇溶解并量瓶中，加甲醇溶解并 稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液2ml2ml与内标溶液与内标溶液3ml3ml，置，置10ml10ml量量 瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取2020 l l注入液相色谱仪，记录色注入液相色谱仪，记录色 谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。谱仪，记

14、录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。 按内标法以峰面积计算，即得。按内标法以峰面积计算，即得。 对照品 对照品 样品 测得量W A/ A/A r rs s A JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *23 定量分析的方法(外标法) 0.20.61.01.41.82.22.63.0 Time, min 0% 50% 100% Rel . Int. (%) JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *24 定量分析的方法(内标法) 0.20.61.01.41.82.22.63.0 Time, min

15、 0% 50% 100% Rel . Int. (%) JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *25 测定法测定法 取本品约取本品约35mg35mg，精密称定，置，精密称定，置10ml10ml棕色量瓶中，精密加入棕色量瓶中，精密加入 内标溶液内标溶液2ml2ml，用石油醚，用石油醚(30(306060C)C)溶解并稀释至刻度，摇匀，吸溶解并稀释至刻度，摇匀，吸 取取1 1 l l注入气相色谱仪，测定，即得。注入气相色谱仪，测定，即得。 本品含本品含 - -蒎烯蒎烯(C(C10 10H H1616) )不得少于 不得少于70%70%。 RR ss C/

16、A C/A f 校正因子 S S x x C/A A f)C(含量 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *26 目的： 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 效能指标： 评价分析方法的尺度评价分析方法的尺度 效能指标包括: 精密度精密度, , 准确度准确度, , 检测限检测限, ,定量限定量限, ,选择性选择性, , 线性与范围线性与范围, , 耐用性耐用性 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *27 一、准确度（一、准确度（accuracy） 系指用该方法测

17、定的结果与真实值或参考值接近的程度。 ( (一一) )含量测定方法含量测定方法 %100(%) %100(%) 加入量 本底量测得量 回收率 加入量 测得量 回收率 回收率(Recovery) 回收试验 加样回收试验 33，至少9 个测定结果 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *28 二、精密度二、精密度(Precision) 系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取 样测定所得结果之接近的程度。 表示：偏差(d)、标准偏差(s),、 相对标准偏差(RSD) 重复性: 同一实验室,同一人多次测定的精密度 中间精密度: 同一实验室，不同人

18、，不同仪器测定的精密度 重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度 29 三、专属性三、专属性(Specificity) v 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采 用的方法能准确测定出被测物的特性。 目视法 信噪比法 S/N=3 四、检测限四、检测限(Limit of Detection, LOD) 药物能被检出的最低浓度(g/ml) 五、定量限五、定量限(Limit of Quantitation, LOQ) 药物能被定量测定的最低浓度(g/ml) 信噪比法 S/N=10 30 影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品 柱的品牌，柱温等 六、线性与范围六、线性与范围

19、(Linearity And Range) v待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系 的程度。 Y=a+bx Y=a+bx （r=0.9999)r=0.9999) 七、耐用性七、耐用性(Robustness) 测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度 31 准确度 精密度 重复性 中间精 密度 专属性 检测限 定量限 线性/ 范围 耐用性 鉴别 杂质定量 杂质限度 含量测定 溶出量测定 检验项目和验证内容 已有重现性验证，不需验证中间精密度 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充 视具体情况予以验证 32 各种含量测定方法对效能指标的要求 1. 容量分析法 用原料药精制

20、品用原料药精制品( (含量含量 99.5 %) )或对照品考察方法的精或对照品考察方法的精 密度，密度，RSD 0.2 % ；回收率一般在；回收率一般在99.7100.3 %之间。之间。 2. UV法 用适当浓度的精制品进行测定，其用适当浓度的精制品进行测定，其RSD1% 。制剂。制剂 的测定，回收率一般应在的测定，回收率一般应在98102之间。之间。 3. HPLC法 要求要求RSD2，回收率回收率98102 %之间。之间。 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *33 一、常用样品的种类、采集和贮藏一、常用样品的种类、采集和贮藏 ( (一一) )

21、血样血样 血浆 (plasma) 血清 (serum) 全血 ( (二二) )唾液唾液 ( (三三) )尿液尿液 用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及 其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违 反医嘱用药。 34 二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术 全血/血浆，组织 (1)蛋白沉淀 (2)调节pH 选择性溶剂提取 RIA 残渣 化学衍生化(提取烃基化) 碱回提酸回提 HPLC UV、FLD、ECD TLC分光光度法 UV、FLD GC FID ECD N/P-FID GC-MS 35 蛋白质 的去除 加入与水混融的有机溶剂加入与水混融的有机溶剂

22、( (乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃) ) 加入中性盐加入中性盐( (饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐) ) 加入强酸加入强酸( (三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸) ) 加入金属沉淀剂加入金属沉淀剂( (CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4、ZnSOZnSO4 4-NaOH-NaOH) ) 缀合物的水解 酸水解酸水解( (盐酸盐酸) ) 酶水解酶水解( (葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素) ) 有机破坏 ( (硝酸硝酸- -高氯酸消化高氯酸消化) ) 分离、纯化 与浓集 液液- -

23、液萃取法液萃取法 (Liquid-Liquid Extraction,LLE) 液液- -固萃取法固萃取法 (Liquid-Solid Extraction,LSE) JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *36 C 2, C 8, C 18, 苯基、环己基 反相萃取 氨基、氰丙基、 二醇基 正相萃取 (分配) 溶于甲醇或甲醇/ 水 硅胶、弗罗里土、 氧化铝 正相萃取 (吸附) 溶于己烷 可溶于有机溶剂样品 JILIN UNIVERSITY COLLEGE OF LIFE SCIENCE *37 强 阳 离 子 交 换 SCX 阳 离 子 型 强 阴 离 子 交 换 SAX 阴 离 子 型 C2,C8,C18, 苯 基 、 环 己 基 反 相 (压 抑 离 子 化 ) 离 子 性 样 品 C2,C8,C18, 苯 基 、 环 己 基 反 相 萃 取 非 离 子 性 样 品 可 溶 于 水 样 品 38 用有机溶剂(甲醇)冲洗洗净 用水冲洗活化 上样 用水或缓冲液冲洗，洗去