细胞计数及铺板

1、用于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板实验步骤1、 准备工作用75%的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。 2）将 培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显 微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入 5mlPBS液清洗一遍，四个方 向晃动倒掉。3、 将0.25%胰酶600ul加入培养皿内，拍皿，上下左右铺匀，37消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁 并分散，制成细胞悬液，然后装到 15ml离心管中。1000r

2、pm,3min.5、弃上清。用PBS 3ml洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗 2次，离心 1000rpm,3min.弃上清。&配细胞稀释液（BSA终浓度为0.1%）.每种细胞需3ml稀释液，共6个样 品，所以配20ml稀释液（无血培20ml+10%BSA 200ul.）7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格 总数/8=数值*104）9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。普通的细胞计数及铺板（免疫荧光，WB等不需定量）实验步骤1、 准备工作用75%的酒精擦拭双手，同时用酒精棉

3、球擦拭超净台。 2）将 培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显 微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入 5mlPBS液清洗一遍，四个方 向晃动倒掉。3、 将0.25%胰酶600ul加入培养皿内，拍皿，上下左右铺匀，37消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.4、加入4ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分 散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，则 需稀释。5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血清的新鲜培养基，混匀

4、。&细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。7、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血清的新鲜培养基1. 不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形, 不规则，失去原有的特点。2. 是否污染：传代或换液24-48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊， 镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增 多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中 取走，以免污染其它细胞 。3. 皿用20天左右，可更换。4. 分清无血培、血培的用途。2012-09-03实作如下:细胞株计数Sh

5、luc114*104 /ml10*105 个/114*104 =0.877 ml=877ulShE138*104/ml725ulSHF140*104/mlP112*104/mlB4178*10 /ml、常规收集细胞、消化、洗涤后，加 3ml细胞稀释液，悬匀后计数如此类推将细胞密度调整为5*105个/ml,每个样品 总体积为2ml.则所需 细胞数为2*5*10 5=10*105 个。稀释过的细胞悬液体积补加细胞稀释液体积87711237251275714128689311075621438从以上调整过密度的细胞悬液中取适量进行transwell及SRB实验二、Tran swell检测肿瘤细胞迁移

6、实验1. 在板孔（下室）中加入600 ul/well含有10%血清培养基作为引诱剂，小室底部 接触培养基。2. 轻轻的在细胞小室的上层加入140ul /well细胞悬液（若细胞密度为5 x105 cell/ml，则上室中共加入 5 x 105 cell/ml x140ul=7 x 104cell）。37 C 孵育 24 小 时（孵育时间根据实验调整，12-36小时）3. 孵育结束，小心取出细胞小室，用棉签轻轻 擦去上室液体。移到预先加入800 ul /well 4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中，室温固定 30分钟。4. 小心取出细胞小室，用吸干上室固定液。（可4保存，隔日再做。）800 ul/ wellPBS加入下室洗3次。室温晾干。5. 800 ul/ well 0. 1%结晶紫染色 30min。6. 迅速将小室浸没到ddH2O浸泡数次，去除多余的染料。吸去上室多余液体完全干燥小室。7. 显微镜下观察结果，随机选取 3个不同的视野拍照。8.三、SRB51取24孔板，