第九章治疗性抗体

1、第九章第九章 治疗性抗体（治疗性抗体（Cure Antibody） 第一节第一节 概述概述 (Introduction) 1890年年Behring和北里柴三郎发现了可特异中和和北里柴三郎发现了可特异中和外毒素的血清组合白喉抗毒素，建立了血清疗法，外毒素的血清组合白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河。开抗体制药之先河。至今，以破伤风抗毒素血清为首紧急预防和治疗至今，以破伤风抗毒素血清为首紧急预防和治疗以毒血症为主要发病机制的疾病的有利武器。以毒血症为主要发病机制的疾病的有利武器。抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。血清中存在一种能特异中和外毒素的组分称之

2、为血清中存在一种能特异中和外毒素的组分称之为抗毒素。将血清中这种具有特异性反应的组分称为抗毒素。将血清中这种具有特异性反应的组分称为抗体。抗体。 一、抗体分子的基本结构（一、抗体分子的基本结构（Structure of Antibody）抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。成和分泌的球蛋白。具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白具有抗体活性及化学结

3、构与抗体相似的球蛋白，统称为，统称为免疫球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。）。 二、抗体分子的生物学功能（二、抗体分子的生物学功能（Biological function of Ab）抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子，其功能是由其分子中不同功能区的特点所决定的。子，其功能是由其分子中不同功能区的特点所决定的。p轻链轻链（Light chain）上有一个轻链易变区（）上有一个轻链易变区（Variable region of light chain，VL）及一个轻链恒定区（）及一个轻链恒定区（Constant re

4、gion of light chain ，CL）。）。p重链重链（Heavy chain）有一个重链易变区（）有一个重链易变区（ Variable region of heavy chain，VH）及）及3-43-4个重链恒定区（个重链恒定区（CH1-CH1-CH4CH4）。）。p抗体分子的各种功能区分别发挥不同的生物学效应。抗体分子的各种功能区分别发挥不同的生物学效应。 Fab与与Ag结合结合PapainFab2Fc木瓜木瓜EPepsinF(ab) 2pFc胃蛋白酶胃蛋白酶FcFc通过胎盘与通过胎盘与补体及补体及Fc受体受体c结合结合 N端端C端端铰链区 IgIg分子的结构模式图分子的结构模

5、式图CDR(CDR(互补决定区）互补决定区）1、特异性地结合抗原（、特异性地结合抗原（Specific combine Ag）是由是由V区（尤其是区（尤其是V区中的超变区）的空间构型决区中的超变区）的空间构型决定的，是可逆的，并受到定的，是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的、温度和电解质浓度的影响。影响。aa极大变化的超变区（极大变化的超变区（Hypervariable region，HV）或互补决定区（）或互补决定区（Complementarity determining region，CDR），），CDR1-CDR3 （各（各5-16aa）：）：可特可特异性结合异性结合Ag框架区（框架

6、区（Framework region，FR）：为）：为片层结片层结构，构，aa序列相对稳定，序列相对稳定，不与不与Ag直接结合。直接结合。2、活化补体（、活化补体（Activate complement）IgM、IgG1、IgG2和和IgG3 可可通过经典途径活化补体。凝聚通过经典途径活化补体。凝聚的的IgA、 IgG4和和IgE等可通过等可通过替代途径活化补体。替代途径活化补体。3、结合、结合Fc受体受体 (Combined Fc receptor) 不同细胞表面具有不同不同细胞表面具有不同Ig的的Fc受体，分别用受体，分别用FcR、 FcR等表示。当抗体与相应抗原结合后等表示。当抗体与相应

7、抗原结合后，由于构型的改变，其，由于构型的改变，其Fc段可与具有相应受体段可与具有相应受体的细胞结合，发挥不同的生物学作用：的细胞结合，发挥不同的生物学作用： IgE与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲高亲和力受体和力受体FcRI结合，发生脱颗粒，引起结合，发生脱颗粒，引起型变型变态反应。态反应。 （2）调理吞噬作用）调理吞噬作用抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间“搭桥搭桥”，加强了吞噬细胞的吞噬作用；，加强了吞噬细胞的吞噬作用；抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原表面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥表

8、面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力；力；抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质；抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质；吞噬细胞吞噬细胞FcR结合抗原抗体复合物后，吞结合抗原抗体复合物后，吞噬细胞可被活化。噬细胞可被活化。（3）发挥抗体依赖的细胞介导的细）发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（胞毒作用（ADCC作用）当作用）当IgG抗体抗体与带有相应抗原靶细胞结合后，可与与带有相应抗原靶细胞结合后，可与嗜中性粒嗜中性粒C、单核、单核C、巨嗜、巨嗜C、NKC等效应等效应C结合，发挥结合，发挥ADCC作用。作用。 4、通过胎盘（、通过胎盘（Through placenta） 在人类，在人类，IgG是唯

9、一可通过胎盘从是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的母体转移给胎儿的Ig，是一种重要的，是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。重要作用。 三、抗体分子的治疗作用（三、抗体分子的治疗作用（Cure effect of Ab） 各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及治疗，在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感染治疗，在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感染性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗原性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗原、受体、激素、神经递质、细胞因子等。肿瘤检测方、受体、激素、神经

10、递质、细胞因子等。肿瘤检测方面，同位素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗面，同位素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优于超声原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优于超声波和核磁共振。在预防方面，抗体主要可用于感染性波和核磁共振。在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的预防，如流感、乙肝等。本节将着重介绍抗体疾病的预防，如流感、乙肝等。本节将着重介绍抗体的治疗作用。的治疗作用。 1、抗体的治疗机制、抗体的治疗机制Cure mechanism of Ab （1）中和作用）中和作用(Neutrilization) 用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素用于感

11、染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。丧失致病力。 （2）示踪或导向作用）示踪或导向作用Tracer or targeted effect 使与其相连的功能性分子特异性地激活或封使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。闭、破坏靶细胞或靶分子。（3）竞争性抑制作用）竞争性抑制作用/拮抗作用拮抗作用（Competitive inhibition） 与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。分子作用产生毒性损害。（4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（Ab dependent

12、cell-mediated cytotoxicity, ADCC）及补）及补体依赖性细胞溶解作用体依赖性细胞溶解作用（Complementarity dependent cytolysis，CDC）。）。（5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。及广泛性。2、抗体的治疗应用（、抗体的治疗应用（Cure application of Ab）随着抗体制备技术的进步，治疗随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体已逐渐从实验室走向临床，性抗体已逐渐从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示了光并在多种疾病的治疗方面展示了光辉的前景。辉的前景。（1）抗

13、肿瘤作用（）抗肿瘤作用（Anti-tumor）由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现，抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现，自从自从1978年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来，年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来，出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体，并于胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体，并于1980年年首次在美国开展了单克隆抗体肿瘤治疗的临床试验。首次在美国开展了单克隆抗体肿瘤治疗的临床试验。 1983年年Mill

14、er等报道了一例经单克隆抗体治疗的等报道了一例经单克隆抗体治疗的淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干扰素治疗后，使用淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干扰素治疗后，使用单克隆抗体治疗存活超过了单克隆抗体治疗存活超过了4年。年。 单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。）。单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的成为一种全新的“生物导弹生物导弹”，可用于导向治疗，可用于导向治疗。单抗给予单抗给

15、予T细胞所必需的重要表面信号分子交细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒细胞毒T淋巴细胞（淋巴细胞（tumor specific cytolytic T lymphocytes，TS-CTLs）可用于特异性、被动性）可用于特异性、被动性的免疫治疗。的免疫治疗。 （2）抗感染作用（）抗感染作用（Anti-infection） 应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感染性疾病，但对不能获得相应疫苗的病毒染性疾病，但对不能获得相应疫苗的病毒感染，感染，AIDS及一些危重情况，如内毒素休及一些

16、危重情况，如内毒素休克等则无效。克等则无效。被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不依赖于不依赖于Fc介导介导 的功能和双价的存在，但的功能和双价的存在，但可能受抗体亲和力影响。可能受抗体亲和力影响。体外无中和病毒作用的抗体外无中和病毒作用的抗Gag单抗在单抗在体内试验中表现出预防及治疗效应，显体内试验中表现出预防及治疗效应，显著延迟了疾病的发作，降低了中枢神经著延迟了疾病的发作，降低了中枢神经系统的病毒水平，且与剂量相关，呈单系统的病毒水平，且与剂量相关，呈单间依赖性。这些结果提示非中和性抗

17、体间依赖性。这些结果提示非中和性抗体的效应与病毒感染的细胞表面表达的效应与病毒感染的细胞表面表达Gag蛋白有关，但机制不清。蛋白有关，但机制不清。 （3）抗器官移植排斥反应（）抗器官移植排斥反应（Anti-repelling of organ transplant）抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。应，预防排斥反应发生。Tc共有的分化抗原共有的分化抗原CD3（Cluster of differentiation ）分子及）分子及IL-2R 对对T细胞的

18、活化细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗、增殖起重要作用，因此抗CD3及抗及抗IL-2R工工程抗体的研究较为多见。程抗体的研究较为多见。 （4）抗血栓形成（）抗血栓形成（Anti-formation of thrombus） 封闭血小板糖蛋白封闭血小板糖蛋白b/a 整合素受体，是血整合素受体，是血栓性疾病治疗上的突破（栓性疾病治疗上的突破（Tubeliverst，1999）。）。近年来许多关于抗近年来许多关于抗GPb/a单抗单抗C7E3的研究的研究表明，表明，C7E3能对能对90%以上的受体产生阻断效应，以上的受体产生阻断效应，减少了减少了35%高危的经皮腔冠脉介入治疗（高危的经皮腔冠脉介入治疗

19、（PTCA）后缺血性并发症及）后缺血性并发症及27% 6个月内的临床再狭窄个月内的临床再狭窄的发生，并证明的发生，并证明C7E3能预防动脉但不能预防静脉能预防动脉但不能预防静脉的血栓再形成。的血栓再形成。 （5）解毒（）解毒（Detoxicating）对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应用抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体用抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体与毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学与毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学，使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流，使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流出，进入血循环中。出，进入血循环

20、中。这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工程抗体对百草枯及蛇毒中毒也有一定作用。程抗体对百草枯及蛇毒中毒也有一定作用。 （ 6 ） 构 建 抗 独 特 型 抗 体 疫 苗 （） 构 建 抗 独 特 型 抗 体 疫 苗 （Constuction of anti-idiotype vaccine）抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗原（内影像作用）而发挥效应。据此抗原（内影像作用）而发挥效应。据此构建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗构建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原，能诱导抗肿瘤免疫反应。原，能诱导抗肿瘤免疫反应。 （7）在自

21、身免疫性疾病及变态反应性）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用疾病中的应用自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。多有关。利用基因工程技术制备针对这些异常抗体利用基因工程技术制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用；或制备能模拟抗原的内影像抗体用于作用；或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。针对不同发病机制，中和体内的自身抗体。针对不同发病机制，治疗方法趋于多样化。治疗方法趋于多样化。n 许多变态反应与许多变态反应与IgE有关。有关。Fc片段可与变应原特异性片段可与变应原特异性

22、IgE竞争竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。还可生产出与介导的组胺释放。还可生产出与患者患者IgE竞争结合变应原的竞争结合变应原的Fab样分子。样分子。 第二节第二节 抗体的分类、结构、功能特点抗体的分类、结构、功能特点（Class、structure and function of Ab）一、抗体的分类（一、抗体的分类（Class） 抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体及基因工抗体分为单克隆抗体、多克隆抗体及基因工程抗体三类。程抗体三类。 （一）多克隆抗体（一）多克隆抗体(Polyclone Ab）传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经传统的抗体制备方法是将

23、一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原物质具有多种各种途径免疫动物，由于抗原物质具有多种抗原决定簇，可刺激机体产生多种抗体形成抗原决定簇，可刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清或体液中，在其血清中是含多种分泌到血清或体液中，在其血清中是含多种抗体的混合物，称为抗体的混合物，称为多克隆抗体，是第一代多克隆抗体，是第一代抗体抗体。精制破伤风抗毒素就是一例。精制破伤风抗毒素就是一例。 （二）单克隆抗体（二）单克隆抗体（Monoclone Ab）识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称

24、之为生的均一性抗体，称之为单克隆抗体单克隆抗体。p其其特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少反应少等优点，已经在基础研究、临床诊断及等优点，已经在基础研究、临床诊断及治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。近年治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。近年来用单抗与核素、各种毒素或药物偶联或基因来用单抗与核素、各种毒素或药物偶联或基因重组制备成导向药物，用于肿瘤的治疗成为研重组制备成导向药物，用于肿瘤的治疗成为研究的重点。究的重点。 p在治疗中应用的单抗，分两种形式在治疗中应用的单抗，分两种形式：一种是全抗，另一种是其酶解片一种是全抗，另一种是其酶解片段段，由于治

25、疗用的单抗均非人源的，由于治疗用的单抗均非人源的，所以去除，所以去除Fc段的酶解片段可以降段的酶解片段可以降低抗原性，减少人抗鼠反应，主要低抗原性，减少人抗鼠反应，主要用于导向治疗用于导向治疗。 1、木瓜蛋白酶的水解片段、木瓜蛋白酶的水解片段（1）裂解部位：）裂解部位：IgG铰链区铰链区H链链间二链链间二硫键近硫键近N端侧切断。端侧切断。（2）裂解片段：）裂解片段： 两个两个Fab段（抗原结合段）段（抗原结合段） 一个一个Fc段（可结晶段）段（可结晶段） 2、蛋白酶的水解片段、蛋白酶的水解片段（1）裂解部位：铰链区）裂解部位：铰链区H链链间二硫键近链链间二硫键近C端切端切（2）裂解片段：）裂解

26、片段： F（ab）/2包括一对完整的包括一对完整的L链和由链间二硫键链和由链间二硫键相连一对略大于相连一对略大于Fab中中Fd的的H链，称为链，称为Fd/ 含含235个氨基酸残基；个氨基酸残基；F（ab）/2具有双价抗体活具有双价抗体活性。性。 Fc可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段，失去可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段，失去其生物学活性。其生物学活性。 应用单克隆抗体全抗或酶解片段在动物试验应用单克隆抗体全抗或酶解片段在动物试验及临床试验中已经取得了较为良好的结果，一及临床试验中已经取得了较为良好的结果，一些实验结果报告如下：些实验结果报告如下：p 131I-CMU72在人胃癌细胞系在人胃癌细

27、胞系MGC80-3裸鼠移植模型的导向裸鼠移植模型的导向治疗中显示有明显的抑制作用，且清除率低，显像时间长，治疗中显示有明显的抑制作用，且清除率低，显像时间长，提示在胃癌临床导向研究上将有光辉的应用前景。提示在胃癌临床导向研究上将有光辉的应用前景。p131I标记抗人扁豆凝聚素结合型甲胎蛋白异质性抗体（标记抗人扁豆凝聚素结合型甲胎蛋白异质性抗体（AFP-R-LCA-McAb）后，在裸鼠实验性肝癌模型中获得良好的治）后，在裸鼠实验性肝癌模型中获得良好的治疗效果，疗效果，85%的肿瘤生长明显抑制，表明的肿瘤生长明显抑制，表明AFP-R-LCA-McAb对人肝癌细胞有较高的特异性和亲和力，有希望成为肝癌

28、放对人肝癌细胞有较高的特异性和亲和力，有希望成为肝癌放免治疗的理想载体。免治疗的理想载体。 抗淋巴细胞单克隆抗体（抗淋巴细胞单克隆抗体（SALM）治疗恶性淋巴）治疗恶性淋巴瘤临床试验显示对非何杰金氏淋巴瘤疗效显著，可瘤临床试验显示对非何杰金氏淋巴瘤疗效显著，可能与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用有关，另外能与抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用有关，另外可能由于可能由于SALM对此类淋巴瘤有特异性疗效。对此类淋巴瘤有特异性疗效。 抗绿脓杆菌单抗进行保护小鼠抗绿脓杆菌感染实抗绿脓杆菌单抗进行保护小鼠抗绿脓杆菌感染实验中作外敷治疗，证明可显著增强人体中性粒细胞验中作外敷治疗，证明可显著增强人体中性粒细胞对

29、绿脓杆菌的吞噬，应用于烧伤创面抗绿脓杆菌感对绿脓杆菌的吞噬，应用于烧伤创面抗绿脓杆菌感染获得满意效果，且未见过敏反应。染获得满意效果，且未见过敏反应。 抗人脑胶质瘤单抗抗人脑胶质瘤单抗S2-39与阿霉素结与阿霉素结合、胃癌单抗合、胃癌单抗3H11与丝裂霉素交联及与丝裂霉素交联及抗人胰腺癌抗人胰腺癌YPC3单抗介导的单抗介导的LAK细细胞体外、体内的试验也均显示较好的胞体外、体内的试验也均显示较好的结果。单克隆抗体具有许多优点，但结果。单克隆抗体具有许多优点，但其本身也其本身也存在一些问题存在一些问题。 （1 1）单克隆抗体的免疫原性）单克隆抗体的免疫原性 l由于人由于人/ /人杂交瘤技术还存在

30、很难人杂交瘤技术还存在很难克服的障碍，目前绝大多数单克隆抗体克服的障碍，目前绝大多数单克隆抗体为鼠源性，因此对人体仍有较强的免疫为鼠源性，因此对人体仍有较强的免疫原性，使用后可产生人抗鼠抗体，从而原性，使用后可产生人抗鼠抗体，从而干扰了单克隆抗体在体内的合理分布，干扰了单克隆抗体在体内的合理分布，重复使用会降低抗体疗效或发生超敏反应。重复使用会降低抗体疗效或发生超敏反应。（2 2）半衰期短）半衰期短 杂交瘤制备的单克隆抗体半衰期一般较短，不杂交瘤制备的单克隆抗体半衰期一般较短，不利于其发挥生物学效应。利于其发挥生物学效应。（3 3）靶吸收差）靶吸收差 单克隆为完整的抗体分子，相对分子质量很单克

31、隆为完整的抗体分子，相对分子质量很大，很难通过血管进入细胞间隙，因此在靶部位大，很难通过血管进入细胞间隙，因此在靶部位（特别是肿瘤），单克隆抗体的摄取量非常低，（特别是肿瘤），单克隆抗体的摄取量非常低，大大降低了治疗效果。酶解片段较全抗在这方面大大降低了治疗效果。酶解片段较全抗在这方面有所改善。有所改善。（4 4）生产复杂，价格昂贵）生产复杂，价格昂贵 （三）基因工程抗体（三）基因工程抗体（Gene Engineering Ab）目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或

32、消失。因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但人人人杂交瘤技术目前未突破，即使研制成功，也还人杂交瘤技术目前未突破，即使研制成功，也还存在人存在人人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲和力低及人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲和力低及产量不高等问题。较好的解决办法是研制基因工程抗产量不高等问题。较好的解决办法是研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体。体，以代替鼠源单克隆抗体。基因工程抗体兴起于基因工程抗体兴起于20世纪世纪80年代早期。这一技年代早期。这一技术是将对抗体基因结构与功能的了解与术是将对抗体基因结构与功能的了解与DNA重组技重组技术相结合，根据研

33、究者的意图在基因水平对抗体分术相结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至人工全合成后导入子进行切割、拼接或修饰，甚至人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称受体细胞表达，产生新型抗体，也称第三代抗体第三代抗体。本章将分四个部分本章将分四个部分：鼠单克隆抗体的人源化、小：鼠单克隆抗体的人源化、小分子抗体、特殊类型的基因工程抗体、人源性抗体分子抗体、特殊类型的基因工程抗体、人源性抗体，对基因工作抗体的原理、制备及近年的进展加以，对基因工作抗体的原理、制备及近年的进展加以详细介绍。详细介绍。 1、鼠单克隆抗体的人源化（、鼠单克隆抗体的人源化（Humanizatio

34、n of Mouse McAb）鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源McAb的免疫原性而将其进行改造，使之和人体的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。因而抗体的人源化有两个基本的原则：保持或因而抗体的人源化有两个基本的原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗体的免疫原性。体的免疫原性。第一代人源化抗体第一代人源化抗体是将鼠是将鼠McAb的可变区

35、的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体（和人抗体的恒定区组成嵌合抗体（Billeta 1993）。其独特的抗原亲和力保持得很好，）。其独特的抗原亲和力保持得很好，但因为有鼠单抗可变区的存在，仍有强烈的但因为有鼠单抗可变区的存在，仍有强烈的HAMA反应。（人抗鼠抗体反应）反应。（人抗鼠抗体反应） 进一步将鼠进一步将鼠McAb可变区中相对保守可变区中相对保守的的FR按成人的按成人的FR框架区（框架区（frame-work region），仅仅保留抗原结合部位），仅仅保留抗原结合部位CDR（即即CDR移植互补决定区），这才是真正移植互补决定区），这才是真正意义上的抗体人源化，该种抗体又称为意义上的抗体

36、人源化，该种抗体又称为CDR移植抗体或改型抗体。移植抗体或改型抗体。 （1）人）人-鼠嵌合抗体（鼠嵌合抗体（Human-mouse Chimeric Ab）由于人抗鼠免疫反应（由于人抗鼠免疫反应（HAMA）90%是针对是针对C区的区的，因此设计用人，因此设计用人C区替代鼠区替代鼠C（constant）区，则可能）区，则可能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。嵌合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体嵌合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因

37、重组与人区基因，经基因重组与人IgC 区基因按一定方式区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达来制备特基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达来制备特异性嵌合抗体。异性嵌合抗体。 通过构建嵌合抗体，用人通过构建嵌合抗体，用人C区取代鼠区取代鼠C区，可区，可以较好解决鼠源性单克隆抗体诱发以较好解决鼠源性单克隆抗体诱发HAMA等不等不良反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克良反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克隆抗体的药物动力学。隆抗体的药物动力学。嵌合抗体已经用于抗肿嵌合抗体已经用于抗肿瘤、抗

38、感染、抗自身免疫等疾病的治疗，并已瘤、抗感染、抗自身免疫等疾病的治疗，并已显示出良好的治疗效果。显示出良好的治疗效果。嵌合抗体诱发嵌合抗体诱发HAMA率仍较高，在导向诊断、导向治疗等方面的应率仍较高，在导向诊断、导向治疗等方面的应用将会受到限制。用将会受到限制。u嵌合抗体已经用于治疗黑色素转移瘤，该抗嵌合抗体已经用于治疗黑色素转移瘤，该抗体含有人体含有人IgG1链链C区与鼠区与鼠V区区14.18，可特异，可特异识别神经母细胞瘤及黑色素瘤表面的识别神经母细胞瘤及黑色素瘤表面的GD2糖脂糖脂。大部分患者症状得到完全或部分缓解，也出。大部分患者症状得到完全或部分缓解，也出现了一些副作用，如关节痛、瘙

39、痒、短时瞳孔现了一些副作用，如关节痛、瘙痒、短时瞳孔反应消失等。一些嵌合抗体分别用于胰腺癌、反应消失等。一些嵌合抗体分别用于胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、急性白血结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、急性白血病等的治疗，证明嵌合抗体有较好的抗肿瘤活病等的治疗，证明嵌合抗体有较好的抗肿瘤活性。性。 （2）改型抗体（）改型抗体（Human ization Antibody人源化人源化Ab）又称人源化抗体，尽管绝大多数又称人源化抗体，尽管绝大多数HAMA反应是反应是针对针对C区的，但有些单克隆抗体如区的，但有些单克隆抗体如OKT3用于人用于人体时，其体时，其HAMA反应则主要是针对反应则主要是针

40、对V区的，如果区的，如果再把嵌合抗体的鼠再把嵌合抗体的鼠FR区替换成人区替换成人FR区，则可能区，则可能减少单克隆抗体的免疫原性。研究指出，抗体与减少单克隆抗体的免疫原性。研究指出，抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其V区的区的6个互补个互补CDR区（互补区（互补Ag决定区）。决定区）。 n 如果把人单克隆抗体的如果把人单克隆抗体的CDR区置换成鼠单区置换成鼠单克隆抗体克隆抗体CDR区，这样的重组抗体的人源化区，这样的重组抗体的人源化可达可达97%，在保留鼠源单克隆抗体特异性与，在保留鼠源单克隆抗体特异性与亲和力的同时，又可大大降低单克隆抗体的亲和力的

41、同时，又可大大降低单克隆抗体的免疫原性，发挥更佳疗效。免疫原性，发挥更佳疗效。n但是，由于人源化抗体的构建需要替换但是，由于人源化抗体的构建需要替换CDR区，而且还得预先得到抗体基因序列，区，而且还得预先得到抗体基因序列，技术相当复杂。技术相当复杂。抗肿瘤治疗抗肿瘤治疗:人源化抗人源化抗CDw52抗体用于治疗两例非何抗体用于治疗两例非何杰金氏淋巴瘤，杰金氏淋巴瘤，43d后仍未发生后仍未发生HAHA反应反应，血液及骨髓中的淋巴瘤细胞全部消失，脾，血液及骨髓中的淋巴瘤细胞全部消失，脾肿大消退，且不抑制骨髓的正常增殖，在治肿大消退，且不抑制骨髓的正常增殖，在治疗白血病的临床试验中表明，抗体无明显的疗

42、白血病的临床试验中表明，抗体无明显的毒性及抗原性。毒性及抗原性。抗类风湿性关节炎抗类风湿性关节炎: : 人源化抗体可用于人源化抗体可用于RARA的临床治疗，的临床治疗，但具有轻度到中度的毒性，且只能短但具有轻度到中度的毒性，且只能短暂改善暂改善RARA症状，说明尚需进一步的改症状，说明尚需进一步的改进。进。 抗移植反应抗移植反应:人源化抗体，包括人源化抗体，包括IL-2T，抗，抗CD3等抗等抗体已经用于抗移植反应这方面的治疗。体已经用于抗移植反应这方面的治疗。抗抗IL-2R人源化抗体抗人源化抗体抗-Tac-H 用于食蟹猴用于食蟹猴异体心脏移植，表明抗异体心脏移植，表明抗-Tac-H是一种较是一

43、种较理想的抗排斥反应物，理想的抗排斥反应物，CD3抗体也同样抗体也同样具有抗移植反应的作用。具有抗移植反应的作用。抗病毒抗病毒:人源化抗人源化抗HSV gB及及gD糖蛋白抗体的亲糖蛋白抗体的亲和力，中和和力，中和HSV以及细胞保护力等明显以及细胞保护力等明显高于其亲本单克隆抗体，如人源化的抗高于其亲本单克隆抗体，如人源化的抗RSV抗体抗体RSHZ19。保护性明显优于人免。保护性明显优于人免疫血清球蛋白。疫血清球蛋白。 抗抗TNF:人源化抗人源化抗TNF-抗体抗体Mab780具有部分中具有部分中和和TNF-能力，并能竞争性拮抗其亲本单能力，并能竞争性拮抗其亲本单克隆抗体或嵌合抗体对克隆抗体或嵌合

44、抗体对TNF-的结合。的结合。抗过敏反应抗过敏反应:人源化抗人源化抗IgE MaE11抗体已经显示了这抗体已经显示了这方面的能力。方面的能力。 2、小分子抗体（、小分子抗体（Small Molecular Ab）完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以穿过血管壁，影响了靶部位对其的摄取。特别穿过血管壁，影响了靶部位对其的摄取。特别是肿瘤细胞，血供本来就不丰富，对抗体的摄是肿瘤细胞，血供本来就不丰富，对抗体的摄取量就更少了。取量就更少了。因此对抗体分子进行改造，使之成为小分子因此对抗体分子进行改造，使之成为小分子抗体。抗体。小分子抗体可分为小分子抗体可分为Fa

45、b抗体、单链抗体、单抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等四种。域抗体、超变区多肽等四种。 （1）Fab抗体抗体l 抗体的抗体的Fab段由重链段由重链V区（区（VH）及）及CH1功能区与功能区与轻链间以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗轻链间以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。原结合功能。lFab抗体是对抗体是对Fab段进行改造而获得的基因工程抗段进行改造而获得的基因工程抗体。即将抗体分子的重链体。即将抗体分子的重链VH区和区和CH1功能区的功能区的cDNA与轻链完整的与轻链完整的cDNA连接在一起，克隆到适连接在一起，克隆到适当的表达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达出有特当的表

46、达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达出有特异性抗原结合能力的异性抗原结合能力的Fab抗体。抗体。Fab抗体大小只有抗体大小只有完整完整IgG的的1/3。下面介绍几个已应用于临床试验的。下面介绍几个已应用于临床试验的治疗性治疗性Fab抗体。抗体。 抗地高辛抗地高辛Fab抗体抗体 : 具有明显的抗地高辛中毒作用，可用于洋地具有明显的抗地高辛中毒作用，可用于洋地黄中毒患者，可恢复房室传导阻滞。黄中毒患者，可恢复房室传导阻滞。抗去郁敏抗去郁敏Fab抗体抗体: 在去郁敏（在去郁敏（desipramine，DMI）心肌中毒）心肌中毒的小鼠模型中应用羊抗去郁敏的小鼠模型中应用羊抗去郁敏Fab后，可明显后，可明显

47、改善改善QRS间隙时间及心率，而且大剂量的效间隙时间及心率，而且大剂量的效果更佳。果更佳。抗血小板抗血小板GPIIbII/IIIa受体受体Fab抗体：抗体： 用不同剂量的抗血小板用不同剂量的抗血小板GPIIbIIIa受体受体Fab m7E3抗体治疗稳定型心绞痛患者，发现抗体治疗稳定型心绞痛患者，发现Fab抗抗体以依赖性方式抑制血小板凝聚。体以依赖性方式抑制血小板凝聚。抗抗HSV Fab抗体：抗体： 抗抗HSV Fab19可特异识别多株不同的可特异识别多株不同的HSV-1及及HSV-2.有有100%的中和作用。的中和作用。（2）单链抗体（）单链抗体（Single chain Ab）在重链在重链V

48、区区cDNA3端（端（VH端）与轻链端）与轻链V区区cDNA5端（端（VL端）之间，用一寡聚核苷酸接端）之间，用一寡聚核苷酸接头（头（linker，14-25个个aa为宜）连接成单链可变为宜）连接成单链可变区基因片段，表达出一具有抗原结合能力的单区基因片段，表达出一具有抗原结合能力的单链抗体多肽，其大小只为完整抗体的链抗体多肽，其大小只为完整抗体的1/6。应用。应用现状简介如下：现状简介如下：放射免疫疗法放射免疫疗法 放射性免疫疗法的原理与体内成像相似，放射性免疫疗法的原理与体内成像相似，必须有足够量的放射性标必须有足够量的放射性标ScFv（单链可变区（单链可变区片段）定位于靶部位，达到发挥放

49、射性治疗片段）定位于靶部位，达到发挥放射性治疗的水平。的水平。ScFv的快速清除使非结合的放射性的快速清除使非结合的放射性标记标记ScFv迅速排出，这也是迅速排出，这也是ScFv有别与有别与Fab片段的重要优点之一。片段的重要优点之一。 免疫毒素治疗免疫毒素治疗 ScFv免疫毒素的细胞毒作用有时比化免疫毒素的细胞毒作用有时比化学合成的免疫毒素高学合成的免疫毒素高15100倍以上，其他倍以上，其他效应功能区可与效应功能区可与ScFv-毒素融合，加强靶细毒素融合，加强靶细胞的杀伤作用。胞的杀伤作用。体内药物解毒作用体内药物解毒作用 由于由于ScFv的清除率比的清除率比Fab快，因此快，因此ScFv

50、可能具可能具有更强的解毒作用，如有更强的解毒作用，如26-10ScFv可用于治疗地高可用于治疗地高辛中毒。辛中毒。 ScFv作为小分子抗体，保留了亲本单克隆抗体结作为小分子抗体，保留了亲本单克隆抗体结合抗原的特异性，又使其抗原性大大降低，其药物合抗原的特异性，又使其抗原性大大降低，其药物动力学优于动力学优于Fab抗体或抗体或IgG等完整抗体。等完整抗体。ScFv相对相对分子质量很小，能有效进入完整抗体无法到达的靶分子质量很小，能有效进入完整抗体无法到达的靶部位，如病毒的部位，如病毒的“峡谷峡谷”部位及肿瘤内部部位及肿瘤内部ScFv。 VHcDNA3端VLcDNA5端 +寡核苷酸 linker

51、重组DNA + 分子载体（vector） 限制酶连接酶体外重组DNA分子 转化E.coli表达ScAb 单链抗体的制备流程图单链抗体的制备流程图（3）单域抗体（）单域抗体（Single domain Ab）抗体结合抗原主要由抗体结合抗原主要由V区决定，只含有区决定，只含有V区区基因片段表达的小分子抗体，即只有基因片段表达的小分子抗体，即只有VH 或或VL 一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子就称为的特异性。这种小分子就称为单域抗体单域抗体（single domain antibody），其相对分子质量仅），其相对分子质量仅为完整抗体分子的

52、为完整抗体分子的1/12，故也称之为小抗体。，故也称之为小抗体。 单域抗体仅有一个结构域，制单域抗体仅有一个结构域，制备相当简单，表达出有活性的抗备相当简单，表达出有活性的抗体片段，因此也不失为一种有良体片段，因此也不失为一种有良好应用前景的基因工程抗体。好应用前景的基因工程抗体。 与与Fab、ScFv相比，单域抗体的相对分子质相比，单域抗体的相对分子质量更小，更容易穿过靶组织，可以阻断病毒表量更小，更容易穿过靶组织，可以阻断病毒表面的面的“峡谷峡谷”部位，加强对实体瘤的渗透，得部位，加强对实体瘤的渗透，得到分辨率更高的成像图谱。但由于到分辨率更高的成像图谱。但由于VH单域抗单域抗体不含有体不

53、含有VL片段，片段，VH的疏水面暴露较大面积的疏水面暴露较大面积，致使其抗原亲和力大幅度下降，非特异性吸，致使其抗原亲和力大幅度下降，非特异性吸附有所增加，因此将单域抗体作为一种治疗性附有所增加，因此将单域抗体作为一种治疗性抗体应用还有许多问题要解决。抗体应用还有许多问题要解决。 （4）超变区多肽（）超变区多肽（hypervariable region polypeptide）抗体结合抗原都要通过抗体结合抗原都要通过CDR来实现，因此来实现，因此CDR是抗体结合抗原的最小结构单位。是抗体结合抗原的最小结构单位。经晶体结构等分析，发现抗体分子中经晶体结构等分析，发现抗体分子中6个个CDR所起的作

54、用是不同的。可以设计出那些在抗原识所起的作用是不同的。可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种这种只含有一个只含有一个CDR多肽的抗体，就称之为超多肽的抗体，就称之为超变区多肽（变区多肽（hypervariable region peptide）。）。 超变区多肽的氨基酸序列与超变区多肽的氨基酸序列与CDRCDR区完全一致区完全一致，大小只有，大小只有16-3016-30个氨基酸，相对分子质量很个氨基酸，相对分子质量很小，对组织细胞具有极强的穿透性，能达到小，

55、对组织细胞具有极强的穿透性，能达到其他抗体不能到达的部位。所制备的其他抗体不能到达的部位。所制备的8787、9292、6McAb VH6McAb VH功能区的功能区的CDR2CDR2多肽，其特异性与多肽，其特异性与亲代抗体相似，能与某些细胞表面的呼肠孤亲代抗体相似，能与某些细胞表面的呼肠孤病毒病毒IIIIII型受体有效结合，使该受体表达下降型受体有效结合，使该受体表达下降，并抑制细胞内，并抑制细胞内DNADNA的合成。的合成。 超变区多肽可用同位素、荧光素标记或与超变区多肽可用同位素、荧光素标记或与毒素、药物等结合，用于疾病的诊断及治疗，毒素、药物等结合，用于疾病的诊断及治疗，已经用于临床检测

56、肿瘤。已经用于临床检测肿瘤。 应该看到，由于只含有一个应该看到，由于只含有一个CDRCDR区，它的区，它的结合抗原能力是不完全及不稳定的，其亲和力结合抗原能力是不完全及不稳定的，其亲和力及非特异性吸附都可能明显增加，相对分子质及非特异性吸附都可能明显增加，相对分子质量极小，在体内相当不稳定，可能还没有完全量极小，在体内相当不稳定，可能还没有完全发挥其生物学效应时已被清除。发挥其生物学效应时已被清除。 3. 3. 特殊类型的基因工程抗体特殊类型的基因工程抗体根据构建方式的不同主要分为三种：根据构建方式的不同主要分为三种： 双特异性抗体；双特异性抗体； 免疫黏连素；免疫黏连素； 催化抗体。催化抗体

57、。 （1 1）双特异性抗体（）双特异性抗体（Bispecific Ab，BsAb）天然的抗体分子为双价单特异性，如果对天然的天然的抗体分子为双价单特异性，如果对天然的抗体分子进行改造，把其他的效应物质如毒素、酶抗体分子进行改造，把其他的效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一定方法与两种杂交抗、细胞因子、受体分子通过一定方法与两种杂交抗体体FabFab片段或片段或V V区（区（VHVH与与VLVL）连接起来，使之即可与）连接起来，使之即可与靶细胞结合，又可介导其他一些效应功能，从而最靶细胞结合，又可介导其他一些效应功能，从而最大限度地杀伤靶细胞。这种具有双特异性的抗体分大限度地杀伤靶细胞。

58、这种具有双特异性的抗体分子就称为双特异性抗体或双功能抗体。子就称为双特异性抗体或双功能抗体。BsAbBsAb（双特异性抗体）是基因（双特异性抗体）是基因工程抗体研究的重点，已经构建工程抗体研究的重点，已经构建了大量的了大量的BsAbBsAb，在基础研究、临，在基础研究、临床诊断、治疗等方面发挥了重要床诊断、治疗等方面发挥了重要的作用。的作用。 抗肿瘤抗肿瘤介导活化的介导活化的T T淋巴细胞。淋巴细胞。介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。除了介导肿瘤细胞与效应细胞的结除了介导肿瘤细胞与效应细胞的结合外，合外，BsAbBsAb还可用于向肿瘤细胞输送还可用于向肿瘤细胞输送免疫毒素

59、。免疫毒素。BsAbBsAb还用于介导其他药物的肿瘤杀还用于介导其他药物的肿瘤杀伤作用伤作用。抗血栓形成抗血栓形成 通过化学交联物制备完整抗纤维蛋白单克隆抗通过化学交联物制备完整抗纤维蛋白单克隆抗体与抗组织纤维蛋白酶原激活物抗体（抗体与抗组织纤维蛋白酶原激活物抗体（抗tPAtPA）BsAbBsAb。在体内、外均能有效地介导纤维蛋白酶原。在体内、外均能有效地介导纤维蛋白酶原激活物与纤维血栓的结合，通过特异聚集激活物与纤维血栓的结合，通过特异聚集tPAtPA于血于血凝块处，在明显减少凝块处，在明显减少tPAtPA量的情况下诱发了其强有量的情况下诱发了其强有力的治疗效应，可以对抗血栓形成，同时也避免

60、力的治疗效应，可以对抗血栓形成，同时也避免纤维蛋白原的溶解及出血的副作用。纤维蛋白原的溶解及出血的副作用。抗感染作用抗感染作用 BsAbBsAb一样适用于介导病原体的代谢。一样适用于介导病原体的代谢。 BsAbBsAb构建法：构建法：化学交联法：化学交联法：SPDPSPDP（琥珀酰胺吡啶二硫酚丙（琥珀酰胺吡啶二硫酚丙酸）随机交联酸）随机交联2 2个个IgIg分子表面上的巯基构建出分子表面上的巯基构建出双功能双功能AbAb。生物学法（杂种生物学法（杂种杂交瘤法）：杂交瘤法）：分泌分泌McAbMcAb的杂交瘤的杂交瘤C C分泌另一种分泌另一种AbAb的脾的脾C C融合融合 杂种杂种- -杂交瘤杂交