浙江大学生物化学实验甲不同植物SOD提取及活力测定

1、不同植物不同植物sod提取及活力测定提取及活力测定1、sod简介简介 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（sod）是一种广泛存在于动、植）是一种广泛存在于动、植物和物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下：剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下： 生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素或生或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能力降低的情况，并由此引发一系列疾病。如脂质的力降低的情况，并由此引发一系列疾病。如脂质的过氧化

2、与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、过氧化与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、辐射损伤、高度中毒等。辐射损伤、高度中毒等。o2 + o2 + 2h+ h2o2 + o2sod不同植物不同植物sod提取及活力测定提取及活力测定 sod由于可以清除氧自由基，因此可以防止这些疾由于可以清除氧自由基，因此可以防止这些疾病的病的产生。而且，产生。而且，sod还可作为一种添加剂，添加还可作为一种添加剂，添加到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由基增多到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由基增多而引起的一系列疾病和延缓衰老方面起到一定作用。而引起的一系列疾病和延缓衰老方面起到一定作用。2、活性测定原

3、理、活性测定原理 sod活性测定的方法很多，常见的有化学法，免疫活性测定的方法很多，常见的有化学法，免疫法和法和等电聚焦三种，其中以化学法应用最普遍。等电聚焦三种，其中以化学法应用最普遍。不同植物不同植物sod提取及活力测定提取及活力测定 本试验即采用化学法来测定本试验即采用化学法来测定sod的活性，使用的试的活性，使用的试剂为氮蓝四唑（剂为氮蓝四唑（nbt），），nbt在光照下能与在光照下能与o2发发生光化还原反应生成蓝色甲潛（生光化还原反应生成蓝色甲潛（qian），该化合物），该化合物在在560nm处具特征光吸收，而处具特征光吸收，而sod能抑制能抑制nbt的光的光化还原，有关的化学反应式

4、如下：化还原，有关的化学反应式如下： 不同植物不同植物sod提取及活力测定提取及活力测定 核黄素，核黄素，temedo2 o2光照光照还原剂还原剂nbt + o2 甲（甲（qian）蓝色，蓝色，560nm处具特征光吸收，处具特征光吸收，od值与值与 o2 含量成正比。含量成正比。光照光照sod光照光照nbt + o2 抑制反应抑制反应抑制原因：抑制原因：sodo2 + o2 + 2h+ h2o2 + o2 sod对对nbt光化还原的抑制程度与光化还原的抑制程度与sod活性成正比，活性成正比，故可通过比色法测出故可通过比色法测出sod的抑制率，以抑制光化还原反的抑制率，以抑制光化还原反应的应的5

5、0%为一个活力单位，即可计算出为一个活力单位，即可计算出sod的活力。的活力。不同植物不同植物sod提取及活力测定提取及活力测定3、试验步骤、试验步骤 各步试验步骤及注意事项解说祥见各步试验步骤及注意事项解说祥见p118。4、实验结果及处理、实验结果及处理 sod活性计算公式：活性计算公式：od对照对照-od测试测试od对照对照10050 稀释倍数稀释倍数 wsod活性（活性（u/g鲜重）鲜重）=（二）（二）sod同工酶活性染色同工酶活性染色1、sod同工酶简介同工酶简介 在高等生物的组织和器官中普遍存在着在高等生物的组织和器官中普遍存在着sod同工酶，同工酶，按按其结合的金属离子的不同可分为

6、：其结合的金属离子的不同可分为：fe-sod，mn-sod，cu、zn-sod三种，这三种酶均能催化氧自三种，这三种酶均能催化氧自由基的清除反应。由基的清除反应。 fe-sod，mn-sod在蛋白质一级结构、空间结构、在蛋白质一级结构、空间结构、分子分子量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感性等方面量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感性等方面与与cu、zn-sod差别较大。差别较大。（二）（二）sod同工酶活性染色同工酶活性染色 mn-sod在真核生物中多为四聚体，在原核生物中在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体。为二聚体。 fe-sod大多数为二聚体。大多数为二聚体。 这两种这两种sod的许多

7、性质都很相似，如两种酶的一级的许多性质都很相似，如两种酶的一级结构和空间结构均很相似，每个亚基的分子量一般结构和空间结构均很相似，每个亚基的分子量一般均为均为23000d，并含有，并含有0510个个mn或或fe原子。不原子。不同来源的同来源的fe-sod和和mn-sod其一级结构的同源性均其一级结构的同源性均很高。很高。（二）（二）sod同工酶活性染色同工酶活性染色 cu、zn-sod则一般是由两个相同的亚基组成的二则一般是由两个相同的亚基组成的二聚体聚体，每个亚基的分子量约为，每个亚基的分子量约为16000d，含一个铜原，含一个铜原子及一个锌原子，不同来源的子及一个锌原子，不同来源的cu、z

8、n-sod其一级其一级结构的同源性也很高。结构的同源性也很高。2、sod同工酶活性染色原理同工酶活性染色原理 由于三种由于三种sod同工酶的分子量和电荷间存在差异，同工酶的分子量和电荷间存在差异，因此因此可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将三种可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将三种sod同工同工酶分开。酶分开。（二）（二）sod同工酶活性染色同工酶活性染色 电泳完后，根据电泳完后，根据sod活性测定原理，将活性测定原理，将nbt溶液加溶液加入凝胶，在光照下，凝胶中不含入凝胶，在光照下，凝胶中不含sod的地方，由于的地方，由于nbt进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈蓝色；进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈

9、蓝色； 而在而在sod同工酶谱带处，由于同工酶谱带处，由于sod抑制抑制nbt的光化的光化还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色背景下的透明带即为背景下的透明带即为sod同工酶谱带。通过这种方同工酶谱带。通过这种方法，可观察到不同来源法，可观察到不同来源sod同工酶之间以及同一来同工酶之间以及同一来源不同发育阶段之间源不同发育阶段之间sod同工酶的差异。同工酶的差异。（二）（二）sod同工酶活性染色同工酶活性染色3、材料与试剂、材料与试剂 试验材料：新鲜植物叶片。试验材料：新鲜植物叶片。 试验试剂：详见试验试剂：详见p117。4、操作方法、操作