直接从细胞培养上清液中简单高效固定胞外组氨酸标记的酶作为有活性的

1、蛋白质纯化翻译 姓名：杨峰 学号：102061413 班级：酿酒1401直接从细胞培养上清液中简单高效固定胞外组氨酸标记的酶作为有活性的,可回收的纳米催化剂:高性能的从废油脂中生产生物柴油 新加坡国立大学化学与生物分子工程 摘要:一种不需要酶的预纯化的简单固定胞外酶方法取得了很大发展. 固定胞外His标记的脂肪酶（His-TLL）的亲和力是通过用巴氏毕赤酵母（h-TLL）的细胞培养上清液直接处理包含长臂镍 - 次氮基三乙酸表面基团（Ni-NTA-MNP）的核 - 壳结构的氧化铁磁性纳米颗粒.让酶有高活性,专一性和高效的催化效率.用纳米生物催化剂His-TLL-MNPs催化一罐废油脂转化为生物柴

2、油的转化效率为94%,显示出优越的回收性能. Ni-NTA-MNPs容易从循环到生物催化剂中再生并且可以反复用于酶的固定.通过从P. pastoris (h-CALB)细胞培养上清液中固定胞外His标记的南极洲假丝酵母脂肪酶B(His-CALB)证明这种方法是通用的.关键词:酶的固定 胞外酶 磁性纳米颗粒 油脂 生物柴油 脂肪酶 酶催化作用以及成为可持续生产化学产品和聚合物的重要绿色工具.固定化酶可以提高稳定性并且通过酶的回收降低酶的成本.因此,越来越多的固定化技术发展起来了.其中,把酶固定在功能性的磁性纳米颗粒上作为纳米生物催化剂吸引了很多注意,因为磁性纳米颗粒独一无二的性能,比如表面积与体

3、积比很大,高分散性且传质限制较小,容易进行磁分离.目前,大多数固定化酶方法都要求预纯化,但这个过程都很贵而且低效.对于胞外酶来说,这个操作更加困难,因为表达的胞外酶在细胞培养液中的浓度很低.因此,开发从细胞培养液上清液直接固定胞外酶而不进行预纯化的简单有效方法是十分必要的.因此,我们要报道的方法是,先用组氨酸标记物标记目标胞外酶,然后用表面含有Ni-NTA的MNPs作为载体,通过亲和力直接从细胞培养液上清液高度特异性的吸附组氨酸标记过的胞外酶.所得到的纳米生物催化剂是有活性和可回收的,并且Ni-NTA-MNPs可以直接从用过的纳米生物催化剂中再生. TLL被选中作为目标胞外酶去证实简单固定方法

4、和实际应用中的固定化酶.已知TLL能催化植物油和甲醇的脂交换用于生产生物柴油,一种清洁的和可再生的取代石油的柴油.然而植物油是可以食用的而且贵.最近,废油脂已经成为生产生物柴油的有吸引力的原料,因为它不可食用而且廉价.由于废油脂的高游离脂肪酸,常规的碱催化过程不再适用了.涉及FFA的酸催化脂化和随后的甘油三脂的碱催化酯交换的两步法失效了.为了高效的将废油脂转化成生物柴油,我们不断努力的开发一种一步式酯化和酯交换工艺.固定化的脂肪酶被证明是适合这个转化过程的.然而酶纯化的要求已经变成了一个阻碍发展合算的酶固定方法和废油脂转化为生物柴油技术的瓶颈.图像一: 从细胞培养液上清液直接固定胞外酶到纳米磁

5、性颗粒上, 用纳米生物催化剂的生物转化和再循环以及从使用的催化剂再生Ni-NTA-MNP。图像二:a细胞生长，蛋白质分泌和酶活性.补料分批培养期间巴氏毕赤酵母（h-TLL）在生物反应器中的细胞密度（），体积活性（）和蛋白质浓度（）。箭头表示用于蛋白质诱导的甲醇的连续进料的起始时间点。 （b，c）使用Ni-NTA-MNP以不同比例（w / w）的MNP与总蛋白（His-TLL：60）从室温和pH 5.5的培养物上清液同时纯化和固定His-TLL的关键性能参数: （b）特异性酶负载量（）和酶加载效率（），（c）比活性（）和总活性回收率（）。数据是来着三分实验的具有偏差的平均值. （d）His-TL

6、LMNPs的FESEM图像。 为了证明固定化方法,通过方案1中所示的途径合成Ni-NTA-MNPs.根据公开的方法,合成含有氧化铁核和甲基丙烯酸缩水甘油酯壳的PGMAMNP,然后用长链二胺官能化得到TDA_MNP.将长臂引入MNP的表面上是为了提供更多的空间和灵活性.以让酶被附着时仍能保持活性,然后引入醛基形成GA_MNPS,与N-双（羧甲基）-L-赖氨酸水合物和随后的氯化镍的进一步反应把PGMAMNP变成Ni-NTA-MNP, 产率为83%.通过TEM,FESEM和DLS表征得到在每个步骤中合成的MNP的尺寸和形态.所有MNPs显示球壳结构和窄分散性。通过工程化包含pPICZA-His-TL

7、L质粒的巴斯德毕赤酵母（h-TLL）和在生物反应器中高细胞密度培养产生胞外His标记的脂肪酶（His-TLL）.如图2a所示, 细胞在第一个13.5小时处于滞后期，之后达到对数期，在23小时细胞密度到达25g cdw / L. 在该点，观察到DO值的突然升高, 这意味着作为碳源的甘油受到了限制. 通过在23小时加入甲醇开始蛋白质诱导, 导致蛋白质浓度和培养上清液活性逐渐增加。诱导13小时后,单位体积的活性开始以一个恒定且很大的比列增加. 在发酵结束时（67h）,单位体积的活性达到2.47 U/mL, 蛋白质浓度为0.6 mg/mL,细胞密度为73.3 gcdw/L. 在不同时间点取得的细胞培养

8、物上清液的SDS-PAGE（图S7）显示诱导后His-TLL（在35kDa处）的表达水平的明显上升,在67小时时细胞培养液上清液中形成了很多His-TLL.从一小部分67小时细胞培养上清液中纯化出来的His-TLL,可推导出His-TLL的表达水平占总细胞外蛋白的60.方案一: 合成Ni-NTA-MNPs和制备纳米催化剂His-TLL-MNPs的路线 在无法通过His标签和Ni-NTA功能之间的亲和性来选择性固定His-TLL之后，将Ni-NTA-MNP加入到培养了67小时的培养物上清液中. 在不同条件下进行固定，并通过固定前后上清液中的His-TLL含量计算酶负载效率。让培养物上清液中的MN

9、Ps与总蛋白质的质量比为12：1,然后观查 2-8小时, 没有观察到对固定存在显着影响。显然，由于高亲和力,2小时的孵育时间足以完成固定.我们也研究了温度的影响. 当温度从4升至25时，特异性酶负载从27.9mg / g至43.5mg / g,酶负载效率从53增加至89（图S4）。当温度从25进一步增加到35,两种性能参数的增加程度小了很多. 因此，我们选择室温来进行后面的固定实验。在室温下,在2小时内观察不同质量比的MNPs和总蛋白质对固定化的影响。如图2b，c所示，当MNPs和总蛋白质的比例从8:1增加至14:1时,特定酶负载几乎线性地从54降低至38mg / g MNP，而酶负载效率从7

10、5线性增加至95. 因为更多的颗粒被使用了。当比率从8:1至12:1的增加,通过用p-NPB测定5分钟固定化酶的活性,发现酶活从6.8 U / mg几乎线性地增加至8.3 U / mg. 而且总酶活性的回收率从71提高至106. 略高于100的活性回收率可能是由于固定后酶活性的轻微增加。MNPs与蛋白质的质量比从12:1至14:1的进一步增加没有进一步提高酶活性回收率和酶的活性。由两个关键性能的参数表现。MNPs与蛋白质的质量比为12：1似乎是合适的. 这些固定化实验在pH5.5下进行，并在该pH下培养细胞。检查其它pH值下固定化表现.。将细胞培养上清液调节至pH8.0，让MNPs与蛋白质的比

11、例为8：1在室温下固定2小时. 在这种条件下特定酶负载达到了61mg / g MNP，酶负载效率为84，His-TLL的酶活性为8.3U / mg和酶活性回收率是百分之百（表S1）. 与pH 5.5相比，这些关键性能参数更好。考虑在较少MNP和中性pH条件下的优点，选择质量比为8：1（w / w）的MNP与蛋白质和8.0的pH作为酶固定的最佳条件.培养物上清液从1毫升放大至10毫升. 结果62mg / g特定酶负载为 MNP，酶负载效率85，His-TLL,比活性为8.2U / mg和活性回收率为100（表S1）。这些关键性能指标几乎与1 mL规模中获得的相同，这证明了使用该方法进行大规模酶固

12、定化的适用性。通过FESEM来分析His-TLL-MNPs纳米载体。如图2d所示，His-TLL-MNP是直径为80nm的均匀球形颗粒，其略大于Ni-NTA-MNP（63nm，通过TEM）。在His-TLL-MNPs和Ni-NTA-MNP（图S5）的FTIR光谱中，表面上的NTA基团在3400cm -1（OH）处具有特征宽吸收，在1725cm -1 C=O有强吸收带）.用SDS-PAGE（图S7）来确认Ni-NTA-MNP是否选择性固定His-TLL。固定化后，上清液在35kDa处的蛋白条带显着降低。用10mM咪唑洗涤纳米生物催化剂His-TLL-MNP，没有洗掉蛋白质。用250mM咪唑进一步

13、洗涤纳米生物催化剂.His-TLL在洗脱的SDSPAGE中产生35kDa的蛋白质单条带。这表明只有His-TLL连接在Ni-NTA-MNP上图3.（a）通过使用纳米生物催化剂His-TLL-MNP来实现FFA的同时酯化和TG与甲醇的酯交换将废油脂转化为生物柴油. （b）在重量%比3（），4（）和5（×）负载下使用纳米生物催化剂His-TLL-MNP，将废油脂（1g）生物转化成生物柴油的时程, 分别在50逐步加入甲醇（在0,2和6小时，每次用63L）。（c）在5重量催化剂负载和50条件下，通过逐步添加甲醇（参见部分b）在24小时用His-TLL-MNPs将废油脂（1g）生物转化成生物柴

14、油的生物转化过程中的His-TLL-MNPs的回收和再利用. 在b和c中的所有实验都进行了三次，数据是具有标准偏差的平均值.用His-TLL-MNP通过FFA的同时酯化和甘油三酯与甲醇的酯交换从含有24重量FFA的废油脂生产生物柴油（图3a）。研究温度和甲醇添加以进行有效的生物转化。在30-50下使用1g废废油脂和50mgHis-TLL-MNP,逐步（63L×3）或一次（189L）添加甲醇反应24小时. 在反应系统中加入硅胶微珠（20重量）以通过吸收水提高FAME产率. 通过GC分析（图S6）确定FAME产率，结果在表1中给出.一次加入甲醇（条目3,40）得到74FAME产率，而逐步

15、加入甲醇（条目2,40）得到81FAME产率. 产量增加是由于通过逐步添加甲醇降低了对酶的毒性. 在逐步加入甲醇时，FAME产率从40（条目2）的81增加至50（条目4）的94.显然，50对于该反应是更好的. 在50下,在相同的酶负载下和相同的转化率下检测游离TLL，同时逐步加入甲醇，得到92FAME产率. 因此，在脂肪的生物转中,His-TLL-MNP甚至显示出比游离TLL稍微更高的产率. 在50下检查不同的催化剂负载; 生物转化的时间进程在图3b中给出。在5重量催化剂负载下实现最高的FAME产率（94）; 在3和4重量催化剂负载下，也分别以87和89产率获得FAME. 在3重量催化剂负载下

16、将油脂转化为FAME的前20分钟内的平均比活性测定为10.5U / mg His-TLL或0.6U / mg His-TLLMNPs. 在这些生物转化中，通过滴定测定，没有FFA保留在最终反应混合物中. 通过1g废油脂和甲醇（63L×3）与50mg His-TLL-MNP和0.2g硅胶微珠在50下反应24小时来检查纳米生物催化剂His-TLL-MNPs的可回收性. 每批后，通过使用磁体从反应混合物和硅胶中分离纳米生物催化剂His-TLL-MNP. 洗涤催化剂并将其重新用于在相同条件下的下一批油脂生物转化为生物柴油. 如图3c所示，纳米生物催化剂的可回收性是优异的，在第七个循环中保持9

17、7的生产率. 我们发现纳米生物催化剂的高可回收性可部分归因于MNP容易恢复并几乎可以完全恢复. 另一个原因是酶对MNP的强亲和力附着，在生物转化和再循环实验期间没有产生可检测的酶渗漏. 此外，固定化酶是高度稳定的，如在循环实验期间的7天的反应中所证实的，没有酶生产力的显着损失. 纳米生物催化剂的再循环和再利用可以显着降低催化剂的成本，并因此降低生物柴油的生产成本.还检查了从His-TLL-MNP再生Ni-NTA-MNP的可能性. 在7次总反应时间为7天的生物转化的7个循环后回收的纳米生物催化剂首先用500mM咪唑洗涤以除去His-TLL. 在用EDTA进一步处理以除去咪唑后，用水洗涤MNP并用

18、氯化镍（II）处理，以100的产率得到Ni-NTA-MNP. 再次使用再生的MNP在确定的最佳条件下从巴斯德毕赤酵母（h-TLL）的细胞培养上清液中固定His-TLL，观察得到酶负载效率，活性回收率和特异性酶负载量为65，80 ，和49mg / g MNPS因此，再生的Ni-NTA-MNPs达到新合成的Ni-NTA-MNPs的这些关键酶固定性能参数的80. 由再生颗粒制备的纳米生物催化剂的比活性达到对于p-NPB水解的8.4U / mg His-TLL，其与由新合成的颗粒制备的纳米生物催化剂的比活性相同. Ni-NTAMNsP从使用的催化剂的有效再生和这些MNPs用于酶固定的再利用降低了纳米载

19、体的成本.为了证明该固定化方法的一般性，还从细胞培养物直接固定了胞外His标记的南极洲假丝酵母脂肪酶B（His-CALB）,通过使用与His-TLL相同的程序，用Ni-NTA-MNPs处理巴斯德毕赤酵母（h-CALB）的上清液. 固定化纳米生物催化剂His-CALB-MNP具有70mg / g MNP的特异性酶负载，94酶负载效率，1.1U / mg His-CALB的特异性酶活性（p-NPB测定）和93活性恢复（表S1）. 由于CALB优选酯化36，检查了纳米生物催化剂His-CALB-MNPs用于在4.5重量催化剂负载（基于油脂）和30下12小时的甲醇的废油脂的FFA的酯化，提供98的转化率FFA。 分离His-CALB-MNP，然后重新用于FFA的酯化的新循环，在第八个循环中保持98的生产率（图S8）.总之，通过使用含有长臂N 1 -NTA表面基团的核 - 壳结构的氧化铁磁性纳米颗粒Ni-NTA-MNP以同时纯化和固定靶His标记的酶来开发用于固定细胞外酶而不进行预纯化的简单且有效的方法 既直接从细胞培养物上清液通过亲和附着来实现固定. 以高产率（83）合成Ni-NTA-MNP