细胞工程复习

1、细胞工程复习资料一：名词解释（20分）细胞分化：是指发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。看护培养：配置好花粉粒悬液和固体培养基后，将完整的花药或花药愈伤组织置于琼脂培养基上，再将灭菌后的滤纸放在花药或愈伤组织上，然后再将欲培养的花粉置于滤纸上培养的方法。细胞杂交：是指在人工控制条件下，不经过有性过程将不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。人工种子：就是将离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护

2、功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。花粉培养：又称小孢子培养，或游离小孢子培养，指在无菌条件下，将花粉从花药中分离出来使其成为分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。条件培养基：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。植物脱毒：利用物理、化学、生物学等方法除去寄生的病毒的无毒植物。成批培养：将一定量的细胞或细胞团接种到一定容积的液体培养基中进行密封培养的方法。体细胞杂交：又称原生质体融合，是指在人工控制条件下，不经过有性过程两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞。胚胎培养：是指在离体条件下使胚或具胚器官发育成幼苗

3、的培养技术。体细胞胚：又称胚状体，是指离体培养植物的体细胞，也可经胚胎发生过程形成在形态上与合子胚相似的结构，这种结构同样具有再生出完整植株的能力。幼胚培养：是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养。互补选择：两个具有不同生理或遗传特性的亲本，在一定的培养条件下形成杂种细胞时能产生互补作用，根据这一特性进行杂种细胞选择的方法称为互补选择法。悬浮培养：是指将游离的单细胞或小的细胞团，按照一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。植板率：（每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总数）*100%种质：是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。玻璃化

4、冻存：是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。微繁殖：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增值并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。原球茎：兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐增大，以后种皮的一端破，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。半连续培养：是指在反应器中投料和接种培养一段时间后，将细胞悬液移出一部分，同时再加入新鲜培养液进行培养的方法。细胞系：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。细胞株：平板培养中，单个细胞经持续

5、分裂，形成许多细胞团，尽可能的使每个细胞团均来自同一个细胞，这种细胞团成为细胞株。器官灌注培养法：利用器官的动静脉系统灌注血液或含有营养和氧气的培养液，以此维持器官在体外的长期生存。接触抑制：细胞相互作用后，如果培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动的现象。核体：应用细胞松弛素处理培养细胞时，细胞内的纤细网状结构便被切断，从而使被细胞膜所覆盖的细胞核移位。经离心分离，便可从胞质体中分离得到被称为核体的东西。非对称融合：是指利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行的融合。对称融合：是指两个完整的细胞原生质体融合，一般在融合子中包含有两个融合亲本的全套染色体和全部的细胞质。

6、胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。选择性筛选：通过改变培养基成分或添加药物对杂交细胞进行筛选的方法称为选择性筛选。原代培养：即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。永久细胞系：也称连续细胞系，是指细胞获得持久性增值能力的细胞群体。有限细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成细胞群体，即具有增值能力，类型均匀的培养细胞一般为有限细胞系。细胞同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期中的某一特定时期。间接筛选：是指借助与突变表现型有关的性状作为选择指示或筛选压的方法。超数排卵：在动物发情周期，用促性腺激素进行处理，诱发其卵巢上大量卵

7、泡同时发育并排卵的技术叫做超数排卵，简称超排。胚胎移植：是指对优秀雌性动物进行超数排卵处理，在其发情配种后，从其生殖道中取出早期胚胎移植到同期发情的普通雌性动物生殖道的相应部位，让其生产后代的技术。胚胎干细胞：一般是从发育早期的胚胎内细胞团中分离培养出来的一种的具有自我更新、无线增值能力、能分化成代表3个胚层组织细胞能力的干细胞。胚胎分割技术：采用显微操作系统将哺乳动物附植前的胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵双生后代。2、 问答（选择、填空，简答，论述80分）一、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？ 1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高温高压蒸汽对生物材

8、料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。 缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。 2）过滤除菌 优点： 物质不会发生变性或丧失功能。3）干热灭菌 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题 4）紫外线灭菌 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。 5）熏蒸消毒 优点：方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 6）药剂喷雾消毒 二、动物细胞培养常用的培养

9、基组成成分有哪几类，在离体培养过程中有哪些作用？ 1）天然培养基： 对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。 2）合成培养基：血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。 3）无血清培养基 细胞外基质能帮助细胞附着和贴壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。 三、外植体的发育程度对愈伤组织的诱导和继代有何影响？ 答：在胚性愈伤组织的诱导中，外植体的发育状态是一个十分重要的因素。外植体在发育过程中，存在一个很短暂的时期，此期外植体内的某些细胞处于未分化或部分分化的状态，这些细胞具有形

10、成胚性愈伤组织的能力，而处于这一发育时期之前或之后的外植体都只能形成非胚性愈伤组织。因此，选择适宜的取材时期可获得理想的培养结果。 四、培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？ 答：（1）有直接发生与间接发生两种途径。 （2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄 。五、胚状体的发育大约要经过哪几个时期？ 答：一、诱导期 二、胚胎发育期 六、控制胚性细胞同步化的方法有哪些？ 答：抑制剂法促进细胞同步分裂；低温处理促进细胞同步分裂；渗透压控制同步化法；同步胚的分段收集筛选法；通气法（乙烯）。七、离体繁殖时外植体选择应注意

11、哪些方面？ 答：生理状态和基因型 其中生理状态包括年龄、取材、季节、生长、环境部位。八、脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？ 物理方法 （1）、高温处理又称热疗法 原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 )即 钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害. (2)、低温处理又称冷冻疗法 原理：降低温度能使病毒活力下降。 化学处理 (1).病毒抗血清预处理 ： 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。 (2).RNA抑制剂处理： 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。放线菌D和放线

12、菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。 （3）.三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-D-呋喃核苷，可脱除马铃薯茎尖中的X.Y.S和M病毒生物脱毒方法原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒） （1）、茎尖分生组织培养 （2）、微体嫁接脱毒 （3）、愈伤组织培养脱毒 （4）、珠心胚培养脱毒 （5）、花药培养脱毒 九、影响茎尖分生组织培养去除病毒的因素都有哪些？ （1）、供体的生理状态和部位 （2）、适当大小的茎尖分生组织的分离 （3） 、茎尖分生组织培养基的类型和培养条件十、无病毒植物的检测方法有哪些？ （1）、直接检测法:直接观察 （2）、电镜检测法 （3 ）

13、、指示植物（敏感植物）法 （4）、血清学检测法 （5）、分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术十一、简述植物细胞大规模培养反应器的类型及原理？ 成批培养：将一定量的细胞或细胞团接种到一定容积的液体培养基中进行密封培养的方法。连续培养：用一定容积的但非封闭的反应器来进行大规模细胞培养的方法。半连续培养：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将细胞悬液移出一部分，同时再加入新鲜培养液进行培养的方法。12、 简述细胞固定化的几种方法。 答：1、包埋法 其中包埋法包括： （1）海藻酸盐包埋法 (2)k-卡拉胶包埋法 (3)琼脂糖包埋法 (4)膜包埋法 2、吸附法 ：（1）聚氨酯泡沫吸附法 （2）尼龙网膜

14、固定法 （3）壳聚糖吸附法 十三、在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？ 答：（一）筛选得到高产细胞系（株）常用方法有： 1、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群） 指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。 2、抗性选择 指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。 3、诱导选择 是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株） （二）培养条件 1适宜温度 2、不断调节PH 3、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个

15、细胞都能合成和积累次生代谢产物。 4、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代谢产物合成都有一定影响。 5、通气量和搅拌转速 6、前体饲喂 7、诱导子的应用：诱导子是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径的物质，可分为生物诱导子和非生物诱导子。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物。 十四、原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？ 液体浅层培养法： 优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发

16、育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 双层培养法液体-固体双层培养法： 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。 固体薄层培养法 优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。十五、PEG融合与电融合各有何特点？电融合的原

17、理是什么？ PEG法特点：融合成本低；融合产生的杂种细胞率较高。但融合较为繁琐，PEG可能导致细胞生活力的下降，对细胞有毒害作用电融合特点：(1)融合率高、重复性强、对原生质体伤害小。 (2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程。 (3)免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。 电融合的原理：交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 十六、体细胞杂交有哪些遗传特征？如何进行鉴定？ 答：1、形态学鉴定、具有两个亲本的特征 2、细胞学鉴定、染色体核型、数目、形态 核型和形态相似，数

18、目相加 3、同工酶鉴定、杂种同工酶谱往往是双亲酶谱的总和 4、分子生物学鉴定十七、试述杂种细胞的选择方法？ 答：一、互补选择法：（1）生长互补选择法 （2）营养缺陷型互补选择法（3）抗性互补选择法 （4）细胞代谢互补选择法 2、 机械选择法：（1）利用融合亲本的形态色泽上的差异筛选杂种细胞 （2）利用荧光素标记分离杂种细胞 （3）应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞 。十八、花药培养过程中低温预处理的原理是什么? 答：低温处理的作用机理：低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育；低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚

19、胎发生。 十九、如何对获得的花粉植株进行倍性鉴定？染色体加倍的方法有哪些？ 答：倍性鉴定有直接鉴定法（染色体计数法）和间接鉴定法两大类，其中间接鉴定法分为1.植株形态观察法 2.细胞形态鉴定法 3.DNA含量测定 4.核体积测量法 5.生化与分子标记鉴定，染色体加倍的方法有1.小苗处理法 2.茎尖处理法 3.培养基处理法 二十、幼胚培养的关键技术是什么? 答:幼胚剥离（关键） 必须把胚从周围的组织中剥离出来。因为胚剥离的成功与否是幼胚能否成功的关键。 幼胚是一种半透明、高黏稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，因此在剥离时一定要注意保湿，无菌，且操作要迅速。 胚柄的存在对于幼胚培养能否成活及成苗率

20、有重要影响。所以幼胚剥离时应带胚柄一同取出。 二十一、离体授粉与离体受精有何区别? 答:离体授粉是指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠完成受精而结实的过程。由于从花粉萌发、到精卵细胞融合形成种子，直至种 子萌发产生幼苗都是在试管内完成的，所以也称其为试管受精。 离体受精是指离体及人工控制的环境下，精卵细胞融合形成合子的过程。它包括配子的分离、雌雄配子融合和合子培养三个阶段。二十二：试述超低温保存的基本原理，常用的超低温保存方法有哪些？ 超低温保存的基本原理：在超低温（液氮）保存过程中，植物细胞内自由水被固化或企划，仅剩下不能被利用的束缚水，酶促反应停止

21、，几乎所有的细胞代谢活动。生长都停止了，当解冻后，又能够恢复再生能力。 超低温保存的方法有：传统的降温冷冻方法、玻璃化保存法、包埋脱水超低温保存、包埋玻璃化法超低温保存。其中，降温冷冻方法包含了快速冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法、逐级冷冻法。 二十三、简述超低温冷冻保存种质资源的基本程序。 答：超低温保存材料的选取材料的预处理降温冷冻及超低温保存解冻再培养超低温保存后细胞或组织活力检测 二十四、举例说明动物细胞培养的目的与用途。 1. 生物制品的生产(如制备单克隆抗体） 2.转基因动物细胞的培养 3.检测有毒物质并判断其强弱 4.医学研究（生理 病理 药理）

22、60;5.器官移植培养 6.筛选抗癌药物二十五、接触抑制与密度抑制有什么异同。 答：接触抑制:细胞从接种到长满容器表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。（正常细胞）密度抑制: 细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。 （恶性细胞）二十六、试举一例说明细胞建系的全过程（列出主要方法、步骤及所需的仪器设备）。答：p252二十七、试述动物细胞生物反应器的发展趋势。P245二十八、细胞融合的原理与技术要点是什么? 原理：膜的流动性。技术要点：两亲本细胞的质膜发生融合，形成同一的质膜。二十九、

23、试述杂交瘤技术生产MCAb的原理？ 答：B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 三十、试述杂交瘤技术生产MCAb的主要技术过程？ 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂

24、交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等 。三十一、简述胚胎的质量鉴定及分级方法。 质量鉴定：1、形态学鉴定 评定的主要内容：卵子是否受精；透明带的规则性；胚胎的色调和透明度；卵裂球的致密程度；卵周隙是否有游离细胞或细胞碎片；胚胎体身的发育阶段与胚胎日龄是不一致。 2、染色检查 1）荧光染色检查： 二乙酸荧光素染色（FDA）：活力越强的细胞显示出淡绿色的荧光越强；死亡或活力降低的细胞不发荧光或仅有微弱荧光 2）台盼蓝染色检查：有活力的细胞不着色，死亡细胞充满着台盼蓝着色颗粒。 3、体外培养法 分为四个级别： A级：形态正常，卵裂球致密、整齐、清晰，发育阶段与日龄一致，无游离的细胞和液泡或很少，变性细胞比例小于10%。可用于胚胎移植。 B级：卵裂球稍微不匀，比较致密、整齐，可见一些游离的细胞和液泡，变性细胞比例占10%30%。可用于胚胎移植。 C级：卵裂球不匀，变形，发育较慢，游离的细胞和液泡较多，变性细胞达30%50%。 D级：卵裂球多数变形、异常，发育缓慢，变性细胞占胚胎大部分，约75%。 三十二：简述胚胎移植的方法及操作步骤