蛋白质的定量分析BCA法

1、会计学1蛋白质的定量分析蛋白质的定量分析BCA法法一一.实验目的实验目的二二.实验原理实验原理三三.实验操作实验操作四四.注意事项注意事项五五.蛋白质定量分析方法蛋白质定量分析方法1、学习、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操法测定蛋白质浓度的原理及操作；作；2、掌握、掌握722型分光光度计、移液管的正确型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。、了解蛋白质含量测定的多种方法。OH-+2BCA螯合物（螯合物（紫蓝色紫蓝色）562nmA值值标准曲线法标准曲线法M待测蛋

2、白质蛋白质+ Cu2+Cu+C待测紫蓝色562nmA待测含量（ug）AM待测BCA法测定蛋白质含量的标准曲线仪器型号仪器型号:722型分光光度计型分光光度计作图人作图人:徐先林徐先林时间时间:2012年年9月月11日日 实验材料实验材料 1、器材 722型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。 （5

3、）待测样品。 管号管号试剂（试剂（ mLmL） 空白管空白管 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 测定管测定管 标准蛋白溶液标准蛋白溶液（0.30.3mg/mlmg/ml） 0.10.1 0.20.2 0.30.3 0.40.4 0.50.5 蒸馏水蒸馏水 0.50.5 0.40.4 0.30.3 0.20.2 0.10.1 待测样品待测样品 0.50.5 BCABCA工作液工作液 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 蛋白质含量蛋白质含量ugug 3030 6060 9090 120120 150150 表1 BCA法测定蛋白质

4、含量数据有改动数据有改动将上述各管混匀后于将上述各管混匀后于37C保温保温30分钟，用分钟，用562nm 波长比色测定吸波长比色测定吸光度值。光度值。空白管？空白管？1-5号管？号管？水浴锅水浴锅1、以牛血清蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐 标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制标准曲线）2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。C=MV250管号空白管12345测定管M(ug)0 306090120150？吸光值(A)测定三次求平均值测定三次求平均值1、实验分组，两人一组2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染3、准确量取

5、试剂，正确使用吸量管4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等6、实验原始记录书写规范，三线表一BCABCA法法二Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法三紫外线（紫外线（UVUV）吸收法）吸收法四五考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法凯氏定氮法凯氏定氮法六双缩脲法双缩脲法蛋白质元素组成特点蛋白质元素组成特点紫外吸收特性紫外吸收特性呈色反应呈色反应方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱

6、性Cu2形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液 某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液 TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响BCA法广泛用于科研工作，其法广泛用于科研工作，其特点特点：1、操作简便，快速、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响品中的去污剂、尿素等化学物质的影响1、该实

7、验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺点，并思考各种方法的适用条件。下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、预习实验操作流程及注意事项。 16%蛋白质的平均含氮量 样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量=样品中氮含量样品中氮含量 16%（或（或6.25）凯氏定氮法凯氏定氮法1、元素组成（主要有主要有C、H、O、N、S ）将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定280nm蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外线吸收法紫外线吸收法共轭双键共轭

8、双键双缩脲法双缩脲法Lowry法法考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法OH-BCA法法BCA分子式BCA试剂盒BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）二辛可酸）紫蓝色管号空白管12345测定管M(ug)0 306090120150？吸光值(A)测定三次求平均值测定三次求平均值BCA法广泛用于科研工作，其法广泛用于科研工作，其特点特点：1、操作简便，快速、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响品中的去污剂、尿素等化学物质的影响1、该实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺点，并思考各种方法的适用条件。下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、预习实验操作