基因敲除小鼠技术

1、精品文档转基因、基因敲入 / 敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术， 该技术从上世纪七八十年代诞生以来， 已有近四十年的历 史，经典技术如 DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式， 成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转 基因、基因敲入 / 敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术， 该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 史，经典技术如 DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰， 在小鼠模型构建方面日趋完善， 并且如同剪切

2、酶和抗体等常规分子生物学试剂的 制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式， 成为一项高度标准化的新兴产业， 催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍 然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而 ZFN和 TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪 80 年代中后期基于 DNA同源重组的原理发展起来的， Capecchi 和 Smithies 在 1987 年根据同源重组（ homologous recombination ）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（target

3、ed integration），这一技术称为 " 基因打靶 " （ gene targeting ）或 " 基因敲除 " （gene knockout ），利用这种 ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠 （ KOMice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi 和 Smithies 于 2007 年与 Evans 分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination ）定义：是指发生在姐妹染色单体 （ sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的 DNA分子之间或分子之内的重新组

4、合。在基因敲除小鼠制作过程中， 需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重 组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图 1 所示：。1 欢迎下载精品文档图 1. 基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、 制作流程图 2. 基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout 载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因( 如 neo 基因， TK 基因等 ) 的载体上，成为重组的 Knockout 载体。2 欢迎下载精品文档2. Knockout ES细胞筛选Knockout

5、载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转入 ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的 Knockout ES克隆。选取 PCR鉴定打靶载体正确插入的 ES基因组 DNA用于 Southern Blot 鉴定，将 Southern Blot 鉴定的 Knockout ES扩大培养并液氮保存。3. Knockout ES 细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的 Knockout ES细胞，以囊胚显微注射的方式将一定数量的 Knockout ES细胞注入特定品系小鼠囊胚中， 然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小鼠的毛色中来源于 ES细胞毛色的比例判断

6、嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。4. 由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系 Knockout 小鼠将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后， 通过 PCR方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的 Knockout 小鼠 (F1 代鼠)。5. Knockout 小鼠生殖系传递鉴定将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配， 通过后代小鼠毛色或 PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。四、 基因敲除常见方法一、常规基因敲除鼠（ Conventional Knockout）。3 欢迎下载精品文档常规基因敲除是通过基因打靶， 把需要敲除的基因的几

7、个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。 该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前， 其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后， 可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为： （ 1）该基

8、因有胚胎致死性； （2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（ Knockin ）。4 欢迎下载精品文档基因敲入小鼠是通过基因打靶， 把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点， 使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：。5 欢迎下载精品文档五、 基因敲除其他方法一、 ZFN技术制作基因敲除鼠ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的 DNA修复过程来实现 DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心 所欲地进行基因组编辑。 这在过去是无法想象的

9、， 传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。这项技术中设计特异性的 ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶（ off target ），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。 也正因为这个原因， 利用 ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。二、 TALEN技术制作基因敲除鼠TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的 TAL 蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其

10、靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用 TAL 的序列模块，可组装成特异结合任意 DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了 ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序 列经常受上下游序列影响等问题， 而具有 ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。 然而同样因为脱靶的问题， 利用 TALEN技术进行小鼠的基 因修饰仍然无法取代传统技术。6 欢迎下载精品文档六、 常见问题与解答1. 什么是 ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。 主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。 所得嵌合体

11、小 鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递， 这样可能获得转基因或打靶基因（来 源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得 50%继承了目的基因的后代。2. 嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在 , 彼此能够耐受 , 不产 生排斥反应 , 相互间处在嵌合状态。 在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞， 使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞， 产。7 欢迎下载精品文档生的个体 也叫嵌合体，

12、即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。3. 条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP 系统是源于 P1噬菌体的一个 DNA重组体系 , 由 Cre 酶和相应的 LoxP 位点组成 , 它能导致重组发生在特定的 DNA序列处 (LoxP 位点 ), 该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定 DNA片段删除。基于 Cre-LoxP 的基因打靶要分两步来进行。 首先要在胚胎干细胞 的基因组中引入 LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。 下一步通过 Cre 介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。 Cre

13、-LoxP 系统既可以在细胞水平上用 Cre 重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别 LoxP 位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子 小鼠与 Cre 转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。4. 如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因， 则称为嵌合体动物。 它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的 ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。5. ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的 cDNA片段或者其他 DNA片段，定点插入到ROSA26位置。 ROSA26是一个安全

14、区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。七、 行业领先企业Taconic Farms,Inc.成立于1952 年，是位于纽约哈得孙河谷地区的一家家族企业。自成立以来，公司一直是世界上最大的实验室啮齿动物供应商之一，在持续 生产高品质、定义明确的大鼠和小鼠方面拥有良好的口碑。 Taconic 在转基因小鼠的定制设计和生产、小鼠和大鼠育种、屏障系统、基因和动物健康方面的专 业经验为利用活体模型开展药物开发的研究人员提供支持。 Taconic 在美国和欧洲设有六个育种工厂和三个服务实验室，员工人数超过 1000 名，致力于从 事技术创新。8 欢迎下载精品文档赛 业生物科技是目前国内探生网提醒：最大的转基因 / 基因敲除鼠