核酸分子杂交研究生课程

1、2021/3/2322021/3/233 单链的核酸分子在合适的条件下单链的核酸分子在合适的条件下, ,与具与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称体的过程称核酸分子杂交（核酸分子杂交（molecular molecular hybridizationhybridization）2021/3/2342021/3/235变性变性复性复性2021/3/236DNADNA加热变性加热变性DNADNA冷却复性冷却复性DNA/RNADNA/RNA杂交杂交TmTm(melting temperature)(melting temperature) :DNA :

2、DNA从部分变性到完全变性是在一个很窄的温度范围内进行从部分变性到完全变性是在一个很窄的温度范围内进行, ,这一温度范围的中点称为熔点温度。这一温度范围的中点称为熔点温度。2021/3/2372021/3/2382021/3/2392021/3/23102021/3/23112021/3/23122021/3/23132021/3/23142021/3/23152021/3/23162021/3/23172021/3/23182021/3/23192021/3/23202021/3/23212021/3/2322 DNADNA探针探针是最常用的核酸探针是最常用的核酸探针,长度在长度在几百几百b

3、p以上的双链或单链以上的双链或单链cDNA片段（片段（通常通常400500bp）放射性或非放射性标记的放射性或非放射性标记的RNARNA分子分子, ,用用于探测与之互补的于探测与之互补的DNADNA或或RNARNA链链,RNA,RNA探探针通常通过克隆相应针通常通过克隆相应DNADNA在体外转录合在体外转录合成而制备成而制备（通常（通常400400500bp500bp） RNARNA探针探针 寡核苷酸寡核苷酸探针探针一般有一般有17-5017-50个核苷酸组成个核苷酸组成, ,可以是寡聚脱氧核醣核酸、可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸寡聚核糖核酸和肽核酸2021/3/23232021

4、/3/23242021/3/2325 随机引物标记随机引物标记 DNADNA缺口平移标记缺口平移标记 全程全程RNARNA探针标记探针标记 化学法全程标记化学法全程标记 3 3末端标记末端标记 5 5末端标记末端标记 随机引物标记随机引物标记最常用最常用DNADNA模板模板引物和模板引物和模板DNADNA结合结合加入加入klenow片断、片断、3种种dNTP和和1种标记种标记dNTP引物延伸引物延伸标记的标记的DNA 片段片段未标记的未标记的DNA 模板模板DNaseDNA聚合酶聚合酶（53核酸外切酶活性核酸外切酶活性53 聚合酶活性）聚合酶活性）3dNTP1dNTP#DNaseDNA聚合酶聚

5、合酶（53核酸外核酸外切酶活性切酶活性53 聚合酶活性聚合酶活性）模板模板DNADNA切开模板切开模板DNADNA形成一到几个碱形成一到几个碱基的缺口基的缺口掺入标记基团掺入标记基团缺口平移缺口平移DNA缺口平移标记缺口平移标记在处酶切在处酶切在处酶切在处酶切从从T7启动子转录启动子转录从从SP6启动子转录启动子转录全程全程RNARNA探针标记探针标记 化学法全程标记化学法全程标记( (生物素或地高辛标记生物素或地高辛标记) ) 与地高辛标记的探针杂交与地高辛标记的探针杂交加入与碱性磷酸酶结合的加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体抗地高辛抗体加入加入底物底物BCIP/ NBTCSPD末端标记末端

6、标记3-末端标记末端标记53355末端突出的末端突出的DNA55333末端标记的末端标记的DNA完整双链完整双链DNAKlenowDNA聚合酶聚合酶32pdNTP变性变性32p末端标记的末端标记的单链单链DNA探针探针末端标记末端标记5-末端标记末端标记2021/3/23322021/3/23332021/3/2334 （一）液相杂交（一）液相杂交 （二）固相杂交（二）固相杂交 （三）原位杂交（三）原位杂交 （四）基因芯片技术（四）基因芯片技术点杂交点杂交/ /狭缝杂交狭缝杂交菌落杂交菌落杂交Northern Northern 杂交杂交SouthernSouthern杂交杂交反点向杂交反点向杂

7、交一、MASA液态芯片二、二、杂交的基本分类杂交的基本分类 MASA是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应间反应, ,并以并以100100种不同荧光编码的微球作为探针种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体术为一体, ,是一种新型生物分子检测技术。其反应是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测等生物的检测

8、。MASAMASA技术的原理技术的原理是是用不同的荧光颜色用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多码使之具有检测多个靶分子的能力个靶分子的能力 二、二、杂交的基本分类杂交的基本分类 概念概念: :反向点杂交反向点杂交(reverse dot blot, (reverse dot blot, RDB)RDB)是是SaikiSaiki等提出的一种斑点杂交技术等提出的一种斑点杂交技术, ,是将是将探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩增产物中是否含有目标基因的技术。增产物中是否含有目标基因的技术。 原理与应用原理与应用: :RDBRD

9、B是先将待用的探针分别点到硝酸纤是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上维素膜或尼龙膜上, ,每个探针一个点并编上号每个探针一个点并编上号, ,再将再将待测的待测的DNADNA样本样本( (一般是经一般是经PCRPCR特异性扩增的产物，在特异性扩增的产物，在PCRPCR引物引物55端预先进行生物素标记，使扩增产物相端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素应标记有生物素) )与之杂交与之杂交; ; 待检样本就会与具有同源序列的探针结合待检样本就会与具有同源序列的探针结合,经洗涤去除未经洗涤去除未结合的结合的DNA样本样本,由于待测的由于待测的DNA样本具有生物素类的标记样本具有生物

10、素类的标记物，结合了待测物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。再经相应的显色反应就能显出杂交信号。 一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。肿瘤研究等。 2.Southern blot2.Southern blot3.Northern blot3.Northern blot4.4.点杂交和狭缝杂交点杂交和狭缝杂交5.5.荧光原位杂交

11、荧光原位杂交6.6.基因芯片基因芯片1.1.菌落杂交菌落杂交2021/3/23452.Southern blot2.Southern blot2021/3/23462.Southern blot2.Southern blotDNA片段在琼脂片段在琼脂糖凝胶上电泳分糖凝胶上电泳分离离膜上固定膜上固定DNA片段片段在缓冲液中将在缓冲液中将标记的探针加标记的探针加到膜上到膜上DNA片段从琼脂片段从琼脂糖凝胶上转印到糖凝胶上转印到膜上膜上杂交信号的杂交信号的检测检测2.Southern blot2.Southern blot2021/3/23482021/3/23492021/3/23502021/3

12、/23512021/3/23522021/3/23532021/3/23542021/3/23552021/3/23562021/3/23572021/3/23582021/3/23592021/3/23603.Northern3.Northern印迹杂交印迹杂交2021/3/2361DNADNA样品点到滤膜上样品点到滤膜上1 1 变性变性2 2 中和中和3 3 固定固定DNADNA4 4 与标记探针杂交与标记探针杂交5 5 洗脱与显影洗脱与显影探针探针DNADNA探针标记探针标记 变性变性将探针加到固定的将探针加到固定的DNADNA上上2021/3/23632021/3/23642021/3

13、/23652021/3/23662021/3/23672021/3/23682021/3/23692021/3/23702021/3/2371荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交 FISH FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术技术是一种非放射性分子遗传学实验技术, ,其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交按照碱基互补配对原则进行杂交, ,经变性经变性退火退火复复性性洗涤后即可形成靶洗涤后即可形成靶DNA DNA 与核酸探针的杂交体，与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测微镜下显影，即可对待测DNADNA进行定性、定量或相对进行定性、定量或相对定位分析。定位分析