克隆载体与表达载体

1、克隆载体克隆 载 体基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自 主复制：不相容性：可 转移性（基因工程中采 用非接合性质粒）（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3） 若干限制性内切酶的单一位点（4）具 有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体 菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能 在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗 菌素选择原理）DSC101ColElPBR322 pUC18 PUC19TA载体噬 菌 体 载 体A噬 菌体其DNA两端的5,末端 各带

2、有12个碱基的互补 单链，即cos位点。有 可替代区，即非必需区。 用外源DNA片段替代这 个区域，不会影响噬菌 体颗粒的形成。（1）基因组大小；去除非必需区，建立外 源DNA片段的克隆或替换位点（2）在 DNA的非必需区插入选择标记:【mZ 基因：基因cl失活（Cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型X 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性 E.coli中的生长会受到限制的表型，称 作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）1）通过裂解过程增殖载体2）载体与外源DNA的酶 切3）外源DNA与载体的连接4）重组噬菌体的体外 包装5）包装噬菌体颗粒的感染6）筛选仏噬菌体载 体的克隆原理）插入式

3、载体置换型载体（取代型载 体）M13噬 菌体 载体M13噬菌体的基因组 为单链DNA。噬菌体颗 粒的大小受其DNA端 点制约的，不存在包装 限制。只感染雄性大肠 杆菌基因间隔区（intergenic region. IG区）基 因II与基因IV之间存在一段5O7bp的 基因间隔区，内含有复制起始位点，是 实施改造、构建人工载体的重点区域。 IG区内只有一个Bsu I切点。（2） 加入酶切位点，在IG区内加入单一内 切酶位点。M13mpl在IG区内插入一 个大肠杆菌的LacZr （a-肽序列）。使克 隆的DNA片段以特左单链的形式输出1、以（+ ）链DNA为摸板，合成互补（一）链， 该双链称复制

4、型DNA （RFDNA）o 2、RFDNA在宿 主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个 拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+ ） 链上，从而阻断了苴互补链，即（一）链的合成， 这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 4、游离 出来的（+ ）链DNA先与基因V的编码产物形成特 异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜， 同时基因V的蛋白质从（+ ） DNA链上脱落下来，M13mpnn代表系列数 字对M13mpl的改进加上常用 的酶切位点。M13mp2：LacZ' 5'端的第13个核昔受体细胞外，M13重组分子筛选简便， 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓 慢

5、，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且 重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量 小，只有1.5 kb余下的M13 （ + ）链DNA则是从其感染的寄主细胞 的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗 粒的。（M13噬菌体产生单双链DNA的机制）酸G突变成 A,产生了一 个EcoR I切 点噬 菌 体一 质 粒 杂 合 载 体黏粒 载体考斯质粒是一类人工构 建的含有X-DNA cos序 列和质粒复制子的的特 殊类型载体。能像入 -DNA那样进行体外包 装，并高效转染受体细 胞；能像质粒那样在受 体细胞中自主复制具有 较高容量的克隆能力： 45kb；具有与同源性序

6、列的质粒进行重组的能 力粘粒（cosmid）是带有cos序列的质粒。 cos序列是K噬菌体DNA中将 DNA包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA序列。黏粒的组成包括质粒复制 起点（colEl）,抗性标记（"?/产），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大DNA片段可达45kb。有 的粘粒载体含有两个cos位点，在某种 程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位 点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具 有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌 体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似 噬菌体入的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA

7、 可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体X 一样感 染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。噬菌 粒载体能像质粒那样在受体细 胞中自主复制能像 M13-DNA那样体外包 装，并高效转染受体细 胞装载量比常规的 M13mp系列要大很多 （10 kb通过克隆双链 DNA能获得同等长度 的单一单链DNA 重组操作简便，筛选容噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬 菌体载体优点，含有ColEl复制起始位 点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌 体DNA间隔区（含有噬菌体DNA复制 起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所 必需的全部顺式作用元件）它具有质粒的复制起点、选择性标记、 多克隆位点等，方便DNA的操作，可 在细

8、胞内稳泄存在；又具有单链噬菌体 的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，1.具有较小分子量基因组DNA,可克隆10kb的外 源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一 个amp基因作为选择记号，便于转化子的选择；3. 拷贝数含呈:髙4.存在着一个多克隆位点区，因此多 种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接 插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆 菌lacZ基因的5'-端编码区，可按照IPTG显色反应 试验筛选6. lacZ基因是程于lac启动子的控制之下， 插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7 含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNApUC118 和pUC11

9、9易可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代 噬菌体分子&带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅 助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA 拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中：9.；在 pUC118和pUCll9这两个载体中，多克隆位点区的 核苜酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一 个可转录克隆基因的正链DNA,另一个则可转录出 负链DNA人工染色体染色体具有复制功能， 利用染色体的复制元件 来驱动外源DNA片段 复制的载体称为人工染 色体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌 体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的 拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。 人工染色体载体拷贝数少，制备困

10、难， 通常采取“穿梭载体”的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复 制起始位点，这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒 复制形式进行高拷贝复制，含有第二受体(如酵母) 端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒 (CEN)以及合适的选择标记。载体在体外与目的 DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制 的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子一 般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆 子常用与受体互补的营养缺陷型。酵母人工染 色体载体 YAC细菌人工染 色体载体BACP1噬菌体人 工染色体载 体PAC质粒载体总结质粒载体类型长度选择标记克隆位点pSClOl天然

11、质粒，属严紧型、低拷贝型9.09 kb四环素抗性Tetr7 个克隆位点：EcoR L Xho k PvuL Hind IILBamH R Sal I、Sam I主要使用EcoR IColEl天然质粒，属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素(colicin ) El 和对El免疫的 基因(immEl)EcoR I位于El内部，插入外源DNA会导致El 失活，使受体菌不能合成El (ColEl ),但仍然 表现岀对El免疫型(ImmEl+)pBR322元件来源复制起点oripMB1系列(来源于ColEl)的高拷贝型复制起点Amp基因 pSP2124质粒的Amp基因Tetr基因 pSClOl 的 T

12、ct基因a4363bp氨节青霉素和四环素抗性24个克隆位点。其中9个会导致TcU基因失活(如BamH I> HindUK Sall)：3个会导致Amp基因失活(Sea L Pvul、Pst I)opuc系列(i)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (ii)氨节青 篷素抗性基因(ampr),但它不再含有原来的核酸内切限 制酶的单识別位点;(iii)大肠杆菌卜半乳糖酶基因(lacZ) 的启动子及其编码*肽链的DNA序列，此结构特称为 如Z基因;(iv)位于lacZ，基因中的靠近5=端的一段多 克隆位点(MCS)区段，但它并不破坏该基因的功能2.7kbAmpicillin 抗 性和la

13、cZ的a 肽互补(蓝白 斑)相结合。10个连续的单一限制酶切位点，位于lac乙基因 的5'端。TA载体耐热聚合酶可在PCR产物的丁端加上一个非配对的 脱氧腺瞟吟核昔(A)。根据这一特点研制岀线性TA 质粒载体，其5,端各带有一个不配对的脱氧胸腺喀 咙(T),用该载体可进行PCR产物的直接克隆。TA载体构建：在一般质粒载体的基础上构建。方法1：先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过Klcnow片 段将酶切的线性载体末端补平方法2：利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化 钝末端质粒载体加T反应形成。目前有很多公司推出了 TA质粒载体。X噬菌体载体入噬菌体载

14、体分类插入式载体一种只具有一 个可供外源 DNA插入的克 隆位点的派生 载体入噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cl基因插入失活：如入gtlO. XNM1149等载体，在cl基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因 插入后将导致cl基因的失活。cl基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生淸晰的噬菌斑。相反，产生混浊的 噬菌斑。Lac Z基因插入失活：如charonl6A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插 入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）置换型载体 （取代型载 体）具有成对的

15、克 隆位点，在这 两个位点之间 的X DNA区段 可以被外源 DNA片段所取 代野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段 这些载体是用Lac 5替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记使用时用EcoRl水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染Ee"使之在E.coli 内繁殖，并裂解E.coli,形成空斑。置换型X噬菌体是使用最广泛的载体。人工染类别元件优点酵母人工染色体 载体YAC是最常用来克隆 很大DNA片段（2Mb）的系统。为构建YAC需要结合四个短序列：即二个端粒、 一个着丝粒和一个ARS元件，

16、并将一适当大小 的外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒 序列位于正确的末端。YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力色体细菌人工染色体 载体BAC是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通疑低拷 贝的质粒载体每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于DNA复制的由ATP驱动的 解旋酶（RcpE）以及三个确保低拷贝质粒 精确分配至子代细胞的基因座（parA , purB ,

17、 和 parC ）以大肠杆菌为寄主，转化率髙，构建BAC文库比YAC 文库更容易：BAC载体以环型超螺旋状态存在，从大肠 杆菌中提取质粒较方便，而从酵母中分离DNA较困难：BAC的复制子来源于F因子，可稳泄遗传，嵌合及重 组现象少；可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方 便快捷；BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚 合酶启动子，可以用于转录获得RNA探针或直接用于插 入片段的末端测序。表达载体分类结构组成及表达元件特点或优点备注质 粒 表 达 载 体原核表达载 体1启动子、2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干 扰载体的稳定性）3核糖体结合位点表达方式有： 组成型表达， 诱导型表达。

18、融合型表达， 分泌型表达。启动子类型:根据作用方式及功能分类组成 型启动子 组织特异启动子又称器官特异性启动子。 诱导型启动子酵母表达载 体来自pBR322基本计架含有该质粒复制起 始位点（ori）, lacZ 基因、bla 或 ampv> tef 等基因。含有 URA3、HIS3、LEU2、TRPX LYS2与特立的宿主营养缺陷突变体互补筛 选或利用zeocin> basticidin （杀稻瘟菌素） 的抗性基因筛选。启动子有GAP、A0X1、 AUG1 和 GALI 等。GAP是组成型启动子。英余是诱导型启 动子。酵母表达载体多为穿梭载体：既可 以在大肠杆菌中繁殖，获得足够的载

19、体 DNA进行体外操作，又可以在酵母中复 制、表达和选择。融合蛋白表达载体：于 外源基因插入位点的C端或N端插入了 1个6XHis标签，或在亍端插入了 a-因由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化 等翻译后修饰反应机制的差异，貞核基因的原 核表达难以获得有活性的蛋白。酵母成为頁核 表达的首选系统。子作为分泌信号Ti 质 粒 表 达 载 体一元 载体一元载体就是含目的基因的中间表达载体 与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所 产生的一种复合型载体，也称为共整合载 体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密 连锁，也称为顺式载体(cis-vector)Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植 物产

20、生冠樱瘤的质粒。根据冠痿瘤合成的 冠痿碱种类，Ti质粒可分为章鱼碱、农杆 碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti 质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori 4 个功能区。T-DNA区是Ti质粒中能转 移到植物细胞内的区域。Vir区位于 T-DNA区的上游，其表达产物可激活 T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域 也称为致病区。Con区该区含有与农杆菌之间接合转 移有关的基因("“)，这些基因受宿主细胞 合成的冠樱碱激活，使Ti质粒在细菌之 间转移。Ori区 调控Ti质粒的自我复制，为复制 起始区构建的基本原理：引入分子质量较小的中间载体，将欲转化的目 的基因及抗性标记基因构建到中间

21、载体上。 将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅 保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25 个碱基序列，构建成所谓卸甲载体。在卸甲载 体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间 载体同源的质粒序列，将中间载体转入含有卸 甲载体的根癌农杆菌中，构建在中间载体上目 的基因可通过同源重组整合到卸甲载体Ti质 粒的T-DNA区，并与卸甲载体Ti质粒一起复 制。二元 载体双元表达载体系统主要包括两个部分： 一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺 失了 T-DNA区域，完全丧失了致瘤作用， 主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位 置上的T-DNA的转移。另一部份是微型 Ti质粒，它在T-DNA

22、左右边界序列之间 提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir 基因可以反式激活T-DNA的转移。与共整合载体所不同的是,它不依赖两个 质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能 在农杆菌内独立复制双元表达载体构件方便，转化效率高于一 元载体。病 毒 表 达 载 体杆状病毒表 达载体杆状病毒表达系统的基本元件：(1)启动子：多个启动子同时表达多个外源 基因。(2)polyA加尾信号：(3)同源重组序 列。(4)穿梭载体必需元件。除带有病毒自 身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的 复制子及以am/f,可以在细菌内进行扩增。(5)筛选标记。重组蛋白具有

23、完整的生物学功能：接近 天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰： 研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方 而的理想模型。表达水平高：最高可使 目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%。 能容纳大分子的插入片段：上限未知。 能同时表达多个基因：在同一细胞内同杆状病毒科病毒，杆状病毒颗粒，双链闭合环 状DNA病毒，专一性感染无脊椎动物将外源基因先克隆到转移载体上，再与病毒基 因组共同转染细胞，通过细胞内的同源重组获 得带有外源基因的重组病毒的策略。时表达多个基因。能表达基因组DNA： 昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能。 对重组蛋白进行定位的功能：如将核蛋 白转送到细胞核上，膜蛋白则左位在膜 上，分泌蛋白则可分泌

24、到细胞外等。腺病毒载体腺病毒DNA末端结构突出特点1)带有 lOObp反向的末端重复序列(ITR),而且在 每一条单链的51末端还共价地连接着末端 结合蛋白，对病毒的复制有重要作用。2) 当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发 地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多 聚体腺病毒载体是目前最为广泛应用的基因 载体，也是唯一基因药物的载体双链 DNA的分子大小约为36kb.可应用于1.基因治疗2.表达真核基因3. 研制疫苗首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转 移质粒，该质粒含有病毒基因组某段早期序 列;然后将一个含有启动子一外源基因-poly A 的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E/、E3或 E4

25、至右侧的ITR区之间，构建成载有外源基 因的穿梭质粒。反 转 录 病毒 载 体泡沬 病毒类从5,端开始依次是：5,长末端重复序列 (5-LTR),带有增强子和启动子序列；psi 序列，又称巾序列，是病毒包装所必须的信 号序列；编码病毒衣冗蛋白；®pol, 编码反转录酶和整合酶(Int)； ®env,编码 病毒颗粒外层包装蛋白：3'长末端重复序 列(3，-LTR),带有poly A加尾信号序列。一类含单链RNA的动物病毒。它的基因 组含有2条相同的正链RNA分子，包装 成二倍体病毒颗粒。(1)在大多数情况下， 反转录病毒的肿瘤基因(one)都能够在正 常的细胞中转录。

26、2)反转录病毒的寄主 范圉相当广，包括无脊椎动物和脊椎动 物。3)反转录病毒具有强启动子，外源 基因可得到有效表达。4)反转录病毒不 但感染效率髙，而且不招致寄主细胞的死 亡载体的构建：分离原病毒DNA-删去部分序列一组入选择 性标记基因、目的基因和调控元件一克隆到含 有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体一转化 大肠杆菌一获得反转录病毒克隆载体一辅助 细胞系(包装细胞系)一扩增慢病 毒类致癌 病毒 类SV40病毒 型转化载体根据SV40 DNA进入敏感动物细胞的转方 向，分为早期转录区和晚期转录区。早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原 基因(small T-antigen)和 T 抗原基因(large T-antigcn)等;含有BamHI等限制性内切核含有能够被貞核细胞识别的有效的启 动子。有许多种动物病毒，在英感染周 期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝 数达到相当高的水平。有些动物病毒具 有控制自己复制的顺式元件和反式作用猿猴空泡病毒 40(Simian vacuolating virus40, SV40)基因组是一种环形双链的DNA,其 大小仅有5243bp,很适于基因操作。导致人