第3章 预处理

1、1、含量低 如胰岛素在胰脏中的含量为0.02%，胆汁中胆红素含量为0.050.08%往往生物活性越高，含量越低！（为什么？）2、杂质多 ：菌丝体细胞碎片、未用完的培养基、各种杂蛋白胶状物、色素、金属离子和其他代谢物3、易变性失活（杂质多） 预处理的目的就是要初步除去杂质，改变滤液性质（降低粘预处理的目的就是要初步除去杂质，改变滤液性质（降低粘度），达到目的产物的初步分离浓缩，以利于后续的分离和精度），达到目的产物的初步分离浓缩，以利于后续的分离和精制过程。制过程。为什么需要预处理？为什么需要预处理？1、生物活性物质来源、存在状态 “胞内”-破碎 、“胞外”、前体-激活（胰蛋白酶提取）存在于膜上

2、的物质要选择适当的溶剂溶解下来2、后续工艺要求：3、稳定性 可被材料中酶（提取RNA)、微生物破坏，还可能受酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线作用改变活性。总体要求：滤液澄清、pH适中、浓度适宜（初级浓缩)绞肉机绞匀浆和组织捣碎工业上的高压匀浆机工业上的高压匀浆机实验室用的组织捣碎匀浆机（原理如同豆浆机）实验室用的组织捣碎匀浆机（原理如同豆浆机）v绞肉机组织糜一些蛋白和酶的提取（如膜蛋白）v匀浆+反复冻融/制备丙酮粉细胞破碎胞内产物的提取v目的：除去两类杂质v可溶性胶状物质：核酸、杂蛋白、多糖v无机盐：Fe3+ Ca2+ Mg2+一、杂蛋白的去除1、凝聚作用(coagula

3、tion)是指：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。无机盐可以使细胞、细胞碎片和蛋白质胶体颗粒发生凝聚作用而被除去 _+电荷密度负电荷分布正电荷分布吸附层 扩散层距固体表面的距离v胶体颗粒保持分散的原因：v带有相同的电荷？排斥v表面水化层的阻碍作用凝聚的原理：无机盐促进胶体凝聚的原理： 在发酵液中加入具有相反电性的电解质：、中和胶粒电性，降低双电层排斥力。 、离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。例图为离子水化作用与胶体争夺结合水而例图为离子水化作用与胶体争夺结合水而破坏胶体水化层的示例。左图游离的正电破坏胶体水化层的示例。左

4、图游离的正电荷争夺结合水形成右图的带水化圈的水化荷争夺结合水形成右图的带水化圈的水化离子和裸露的胶体粒子。离子和裸露的胶体粒子。 影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。 由于大多数杂蛋白在生理由于大多数杂蛋白在生理pH下，羧基水解程度下，羧基水解程度大于氨基，因此一般蛋白质胶体带负电荷；所大于氨基，因此一般蛋白质胶体带负电荷；所以经常用带正电荷的金属离子来中和，促使其以经常

5、用带正电荷的金属离子来中和，促使其凝聚。无机盐用量过度，有可能是胶体吸附过凝聚。无机盐用量过度，有可能是胶体吸附过多的无机盐而带正电荷之间重新产生排斥力，多的无机盐而带正电荷之间重新产生排斥力，是胶体系统更加稳定是胶体系统更加稳定2、加入絮凝剂 絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。聚丙烯酰胺 絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团。v胶体中加入絮凝剂时，胶体强烈地吸附在絮凝剂表面的功能基团上，高分子絮凝剂的不同链节分别吸附在不同的颗粒表面，产生架桥联接粗

6、大的絮凝团沉淀下来絮凝剂过量絮凝剂过量包裹胶体，包裹胶体，稳定胶体稳定胶体v聚丙烯酰胺絮凝原理主要是靠吸附和架桥，通过高分子链上的带电基团吸附作用，将细小的颗粒拉到一起从而实现加速沉降，达到加快固液分离的目的。 影响絮凝效果的因素主要有： （1）絮凝剂的分子量： （2）絮凝剂的用量： （3）溶液pH值： （4）搅拌速度和时间：各个相互影响，做单因子预实验后，正交试验、均匀实验或响应面实验（设计、交互作用分析）进一步优化絮凝参数v（1）絮凝剂分子量架桥效果溶解度v （2）絮凝剂的用量：适中，过多引起吸附饱和在胶体表面形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，使胶粒更稳定v（3）溶液pH值：电离度伸展

7、度架桥效果v（4）搅拌速度和时间：先快后慢v 3、变性沉淀v变性作用 ：化学（有机溶剂、酸碱、脲、胍）、物理（热、辐射、高压、表面张力）v考虑目的物的稳定性v举例：链霉素提取 pH3.03.5 ;70 75 保温0.5h,使蛋白凝固沉淀，粘度降低到1/6，过滤速度提高3倍。 4、等电点沉淀 5、加各种沉淀剂沉淀 6、吸附 ：加入吸附剂（活性碳）或反应剂 例如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3Fe(CN)62的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。 黄血盐：三水合六氰合铁()酸钾。为铁和氰形成的配位化合物。俗称黄血盐。 1.可用酶转化为单糖（真菌分泌的粘多糖

8、、发酵结束后残留糖，如淀粉、糊精，加淀粉酶等） 2.粘多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）生成沉淀去除。 1、离子交换法 2、沉淀法 Ca2+ 草酸 Mg2+ 磷酸盐,三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA一、机械法 1、匀

9、浆法 2、珠磨法 3、超声波三、化学法 1、化学试剂处理 2、酶解法 3、制成丙酮粉二、物理法 1、干燥 2、冻融 3、渗透压冲击概述（一）高压匀浆器 （二）高速珠磨机此处狭此处狭缝下只缝下只可让破可让破碎后的碎后的料液通料液通过而玻过而玻璃珠不璃珠不能通过！能通过！v高速珠磨机，其罐体由不锈钢或陶瓷材料作成，内装一定数量的钢球或瓷球。v当罐体转动时，由于球体之间以及球体与罐壁之间的摩擦作用，使得球体随罐壁转动上升到一定高度后以抛物线方式往下落，从而对物料产生撞击和研磨作用并使物料高度粉碎。剪切力+研磨（三）超声波振荡器（一）干燥法 空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥干燥后菌体细胞膜渗透性

10、变化而自溶（二）冻融法 细胞内冰晶引起细胞膨胀而破碎（三）渗透压冲击法 先把细胞放在高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨胀，破裂，使产物释放至溶液中 对革兰氏阳性菌不适宜（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 ：可以溶去除细胞壁以外的大部分组分（碱 裂解法提取DNA） 2、用脂溶性有机溶剂：溶解细胞膜上的脂质化合物，使细胞结构破坏 稳定性 3、表面活性剂（二）酶解法（三）制成丙酮粉：丙酮快速脱水，破坏蛋白质与脂质结合键亦称丙酮干制剂。是微生物或生物组织，有时是蛋白质，酶的提取物用丙酮脱水的干制品。 （一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨（二）、目的

11、物的稳定性（三）、破碎效果和产物释放率表 3-1 常用的细胞破碎方法 方法 原理 特点 匀浆法 基于液相的剪切力 适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广泛应用， 但不适用于某些高度分支的微生物， 另外产热大，可能造成生物活性物质失活 珠磨法 利用研磨作用破碎 适用面广，处理量大，在工业生产上广泛应用；产热大，可能造成生物活性物质失活 机 械 法 超声波 利用超声波的空穴作用使细胞破碎 产热量大，且散热不易，成本高，仅适用于小量样品破碎 干燥法 干燥后的菌体细胞膜渗透性变化，自溶 较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性 冻融法 胞内冰晶引起细胞膨胀破裂 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅适于在实验室中使用 物 理 法 渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细胞快速膨胀破裂 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 化学试剂处理 应用化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞组分 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，可应用于大规模生产 酶解法 用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键 反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用 化 学 法 制成丙酮粉 丙酮迅速脱水，破坏蛋白质与脂质结合的键 迅速脱水，可减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放 一、过滤（一）过滤方式 1、常规过滤 2、错流过滤错流过滤（二）、过滤设备1、板框过滤机2