肿瘤细胞培养课件

1、肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养 细胞培养技术细胞培养技术肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，当肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。肿瘤细胞培养是研究肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。用。优点：优点：可免受机体内环境因素的影响可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的

2、影响。、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。既便于从既便于从细胞水平上细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子基因及分子水平水平上研究癌变的发生机理。上研究癌变的发生机理。可可长期传代、保存长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。可用于可用于快速快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。筛选抗癌药物和研究耐药机理。研究周期短，比较经济研究周期短，比较经济。缺点：缺点：长期培养可使细胞生物学长期培养可使细胞生物学特性发生改变特性发生改变；体外实验所得的结果；体外实验所得的结果不能完全代不能完

3、全代表表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。一、体外培养肿瘤细胞的特征一、体外培养肿瘤细胞的特征肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在内或在体外，在形态、生长增殖、遗传性形态、生长增殖、遗传性状状等方面都有显著的不同。等方面都有显著的不同。1 1形态和性状形态和性状(1)(1)形态形态不规则不规则，细胞界限清晰，核大，核仁数目多，核膜和核仁轮廓，细胞界限清晰，核大，核仁数目多，核膜和核仁轮廓清楚。清楚。(2)(2)折光性强折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，微丝走行不规则，电镜观察细胞表面

4、微绒毛多而细密，微丝走行不规则，与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。2.2.培养特征培养特征(1)(1)生长方向性消失，生长方向性消失，失去失去接触抑制接触抑制，数量增多时可呈，数量增多时可呈多层重叠生长。多层重叠生长。(2)(2)失去失去锚着依赖性锚着依赖性（停泊（停泊依赖性），可在琼脂、甲基依赖性），可在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。纤维素等支撑物上生长。NIH3T3细胞经癌基因转化后出现转化灶（细胞经癌基因转化后出现转化灶（100）转化区转化区（密集重叠生长）（密集重叠生长）非转化区非转化区2.2.培养特征培养特征(3)(3)营养要求不

5、高，在营养要求不高，在无血清或低血清（无血清或低血清（ 2%5% 2%5% ）条件条件下仍能生长，下仍能生长，成为检测细胞恶变的一个指标。成为检测细胞恶变的一个指标。 。(4)(4)能能自分泌自分泌促增殖因子，软琼脂培养促增殖因子，软琼脂培养单个细胞能形成集落单个细胞能形成集落。3 3永生性永生性(1)(1)永生性（永生性（immortalityimmortality）也称）也称不死性不死性，体外培养表现为可，体外培养表现为可无限传代无限传代而而不死亡，体外培养的肿瘤细胞系、株都具有这种特性。不死亡，体外培养的肿瘤细胞系、株都具有这种特性。(2)(2)体外培养的体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性

6、（包括侵润性）是两种性状永生性和体内肿瘤的恶性（包括侵润性）是两种性状，受，受不同基因调控。不同基因调控。(3)(3)多数恶性肿瘤在体外培养时并不那么容易成功，永生性是在体外培养多数恶性肿瘤在体外培养时并不那么容易成功，永生性是在体外培养后获得的后获得的。永生性不等于恶性永生性不等于恶性，某些细胞如，某些细胞如NIH3T3NIH3T3、Rat-1Rat-1、10T1/210T1/2等具有永生性而等具有永生性而无恶性。无恶性。4 4致瘤性致瘤性细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞接种同种动物或裸鼠后的致瘤性是客观反映细胞恶性程度细胞恶性程度的指标。的指标。具体做法是：具体做法是：1 1

7、）收集培养的肿瘤细胞，用无血清培养液洗）收集培养的肿瘤细胞，用无血清培养液洗一遍；一遍；2 2）计数后将）计数后将0.2ml0.2ml含含2 21061062 2107107个细胞个细胞的细胞悬液注射到动物皮下。的细胞悬液注射到动物皮下。3 3）约一个月左右（最短在）约一个月左右（最短在3 3天后），可见注天后），可见注射局部有肿瘤出现，甚至有转移瘤形成。射局部有肿瘤出现，甚至有转移瘤形成。5 5浸润性浸润性 浸润性浸润性是肿瘤细胞是肿瘤细胞扩张性增殖扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组持有这种特性，当与正常

8、组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能织中，甚至能穿透人工隔膜穿透人工隔膜。6 6异质性异质性通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤是由具有不同生物通过肿瘤细胞培养及克隆分析发现，同一肿瘤是由具有不同生物学特征的细胞亚群构成的。这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能学特征的细胞亚群构成的。这些细胞亚群的浸润性、生长率、转移能力、核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均不同，这种特性被力、核型、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性均不同，这种特性被称为肿瘤细胞的称为肿瘤细胞的异质性（异质性（heterogeneityheterogeneity）。同一肿瘤内的细胞活力有差别，其中同一肿瘤内的细

9、胞活力有差别，其中有的衰老、退化，有的处于有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有处于活跃增殖的周期阻滞状态，只有处于活跃增殖的肿瘤干细胞肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的才是支持肿瘤生长的成分成分。7 7细胞遗传性细胞遗传性 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体异倍体或多倍体生长。或多倍体生长。二、肿瘤细胞系的建立二、肿瘤细胞系的建立恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括从人或动物恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括从人或动物恶性肿瘤取材恶性肿瘤取材建立癌细胞系和正常细胞在建立癌细胞系和正常细胞在体外经体外经理化、生物因素诱发理化、生物因素诱发的转化细胞系。的

10、转化细胞系。转化细胞系可以是转化细胞系可以是恶性转化细胞恶性转化细胞和和一般转化细胞一般转化细胞两种。两种。恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永生性和恶永生性和恶性表型性表型，对此两种来源的细胞系鉴定也是相似的，对此两种来源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。一般转化细胞系只具有一般转化细胞系只具有无限生长能力无限生长能力，不具有恶，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用模型而被应用。癌细胞培养的最主要的问题是从体内到体外环境的改癌细胞培养的最主要的

11、问题是从体内到体外环境的改变。培养中发现，有些肿瘤在体内生长，但在体外却变。培养中发现，有些肿瘤在体内生长，但在体外却难以生长。难以生长。1.1.依赖性依赖性：肿瘤细胞仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系：肿瘤细胞：肿瘤细胞仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系：肿瘤细胞间的相互依存；肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。间的相互依存；肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。 体外分散培养和排体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性。殖生长的活性。2.2. 肿瘤细胞的肿瘤细胞的自分泌也会因分散培

12、养而被稀释自分泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力。降低肿瘤细胞的生长增殖力。3.3.并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的生命周期，只有并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的生命周期，只有干细胞干细胞才有强才有强的增殖生长能力，但这些的增殖生长能力，但这些细胞数量很少细胞数量很少。4.4. 离体培养肿瘤细胞可能需求与体内离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件相似的特殊生存条件。癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括括标本收集和处理、原代培养、传代、换液、标本收集和处理、原代培养、传

13、代、换液、冻存、复苏冻存、复苏等过程。等过程。培养成功关键在于：培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。等几个方面。取材：取材：培养培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，实体瘤患者可肿瘤细胞的材料一般来自患者，实体瘤患者可取取原发肿瘤组织原发肿瘤组织或或转移灶转移灶。有胸、腹水患者可取有胸、腹水患者可取胸水或腹水胸水或腹水。白血病患者可取白血病患者可取血液或骨髓液血液或骨髓液。实体瘤实体瘤取材方法：取材方法： 取术后或活检取术后或活检切取的切取的标本标本立即立即浸入无血清培养液浸入无血清培养液并及时进行并及时进

14、行培养。尽可培养。尽可能能去除溃疡及坏死组织去除溃疡及坏死组织，避免污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在，避免污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含含两两性霉素性霉素B B 、青霉素青霉素、链霉素的链霉素的培养液中浸泡培养液中浸泡10102020分钟，再用洗液反复分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。冲洗干净后，再作培养。体体腔腔液取材方法液取材方法：在无菌条件下采取体腔液在无菌条件下采取体腔液( (胸水或腹水胸水或腹水) )，不需加抗凝剂，可，不需加抗凝剂，可直接离心直接离心收收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。血液

15、血液( (骨髓骨髓) )取材法取材法白血病患者可取血液或骨髓，主要以取白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血外周血为研究对象，用为研究对象，用肝素抗凝肝素抗凝的注射器无菌抽取的注射器无菌抽取5 510mL10mL外周血，置于试管中立刻分离培养外周血，置于试管中立刻分离培养。标本标本于于4 4度放置不宜超过度放置不宜超过24h24h。人人癌细胞建系必须要有癌细胞建系必须要有完整的记录完整的记录，包括组织来源、病，包括组织来源、病人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系的重要材明确分类分期）、术

16、前放化疗情况，为细胞建系的重要材料。料。为了鉴定建立的为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性细胞系来源和生物学特性，最好留有病，最好留有病人正常组织和血标本。人正常组织和血标本。肿瘤细胞的分离培养肿瘤细胞的分离培养肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用用RPMI1640RPMI1640，DMEMDMEM、Mc-Coy-5AMc-Coy-5A等培养基，血清浓度不等培养基，血清浓度不高，高，10%10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清或原患者血清(1%(1%2%)2%)以利细胞生长，培养方

17、法很多以利细胞生长，培养方法很多，主要有，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。原代细胞的培养方法如下：等。原代细胞的培养方法如下：1.1.组织块培养法组织块培养法将取得的瘤组织去除脂肪将取得的瘤组织去除脂肪 结缔组织及坏死部分，在平皿中结缔组织及坏死部分，在平皿中用用HanksHanks液洗液洗3 3次，剪碎组织，切成次，剪碎组织，切成12mm12mm3 3小块，接种于事先涂小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37 5%37 5%或加盖瓶塞在普通或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。恒温箱中培养。2 2、酶消化

18、法、酶消化法在上述的碎组织块中加入在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或(2000u/ml胶原酶胶原酶)在在37水浴中消化水浴中消化30分钟分钟(或更长一些或更长一些)，去除消化液，洗液洗，去除消化液，洗液洗3次次，培养液洗，培养液洗1次，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细次，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以胞悬液，计数。以510810108/L细胞浓度，在含有细胞浓度，在含有10%小牛小牛血清的血清的RPMI1640(或或DMEM)中中37 5% CO2下分瓶下分瓶(或皿或皿)培养。培养。胰蛋白酶胰蛋白酶是分离细胞最常应用的酶，但它对结缔是分离细胞

19、最常应用的酶，但它对结缔组织的消化能力有限，组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿适合含结缔组织较少的肿瘤瘤，并且对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。，并且对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。胶原蛋白酶胶原蛋白酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，适于分离纤维性组织、上皮及癌组胞影响不大，适于分离纤维性组织、上皮及癌组织。织。3 3、钽网培养法、钽网培养法在一张面积约为在一张面积约为1cm1cm2 2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块肿瘤组织块(1-2mm(1-2mm3 3大小大小) )，用镊子轻压，使其粘于网上，

20、再把，用镊子轻压，使其粘于网上，再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37 37 5% CO25% CO2下培养，每隔下培养，每隔2-32-3天换液一次，天换液一次，5 5天后可见有上皮细胞从天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。胞。4 4、脱落细胞法、脱落细胞法 将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2 2次后，次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细用刀片将肿瘤组织切成

21、细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶得较纯的上层细胞，于培养瓶( (或皿或皿) )中、中、37 5% CO37 5% CO2 2下培下培养，每隔养，每隔2 23 3天换液，天换液，7 71010天上皮细胞逐渐长成单层。天上皮细胞逐渐长成单层。成纤维细胞的去除成纤维细胞的去除在在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若

22、不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。终能抑制肿瘤细胞的生长。尽早排除成纤维细胞，是肿瘤细胞长期培养建系的关键。尽早排除成纤维细胞，是肿瘤细胞长期培养建系的关键。常用方法包括：常用方法包括：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。原酶消化法、密度梯度离心法。一、机械刮除法一、机械刮除法 1 1. .标记：标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。细胞的部位。2 2. .刮

23、除：刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。视下，刮除无标记空间。3 3. .用用HanksHanks液液冲洗冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞。一两次，洗除被刮掉的细胞。4 4. .注入培养液注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。除至完全除掉为止。二、反复帖壁法二、反复帖壁法 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，反复贴壁去除成纤维细胞。根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，反复贴壁去除成纤维细胞。1.1.待待细胞达一定数量后，倒

24、出旧培养液，胰酶消化后，细胞达一定数量后，倒出旧培养液，胰酶消化后，HanksHanks冲洗冲洗2 2次，加次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。 2 2. .取编号为取编号为A A、B B、C C三个培养瓶。先把悬液接种入三个培养瓶。先把悬液接种入A A培养瓶，置温箱静止培培养瓶，置温箱静止培养养5 52020分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入液，再接种入B B培养瓶中后，向培养瓶中后，向A A瓶补充少许完全培养液置温箱中继续培养。瓶补充少许完全培养液置温箱中

25、继续培养。 3 3. .培养培养B B瓶中细胞瓶中细胞5 52020分钟后，按处理分钟后，按处理A A的方法，把培养液注入的方法，把培养液注入C C培养瓶中，培养瓶中，再向再向B B瓶补加完全培养基。瓶补加完全培养基。 三、酶消化排除法三、酶消化排除法1 1. .先用先用PBSPBS漂洗细胞一次，然后换成消化液（漂洗细胞一次，然后换成消化液（0.250.25胰酶胰酶+0.02+0.02EDTAEDTA）消化细胞，在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，发现消化细胞，在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，发现纤维样细胞纤维样细胞脱变脱变便立即停止消化。便立即停止消化。2 2. .把消化液离心弃去上清，

26、沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。 四、胶原酶消化法四、胶原酶消化法利用成纤维细胞对胶原较为利用成纤维细胞对胶原较为敏感敏感的特点，通过消化进行选择。的特点，通过消化进行选择。1.1.用用0.5mg/0.5mg/mLmL

27、的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。维细胞被除掉后即终止消化。2.2.用用HanksHanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。五、密度梯度离心法五、密度梯度离心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.0251.0251.0851.085的密度梯度分离的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，液，加入细胞悬液后，2500r/min2500r/min离心离心1010

28、分钟，在比重分钟，在比重1.0251.0251.0501.050层为成纤维细胞，在比重为层为成纤维细胞，在比重为1.0651.0651.0851.085层为上皮细胞，层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液将收集的上皮细胞经洗液3 3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。肿瘤细胞原代培养注意事项肿瘤细胞原代培养注意事项1.1.培养材料应取自培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好肿瘤细胞集中、活力较好的部分，的部分，取取 材后应立即材后应立即培养并存放于培养液中。培养并存放于培养液中。2.2.取材和培养过程中取材和培养过程中防止细菌和霉菌污染防止细菌和霉菌污染。3 3. .

29、尽快尽快清除清除培养物中混有的培养物中混有的成纤维细胞成纤维细胞。4 4. .若癌组织中有淋巴细胞浸润，采用若癌组织中有淋巴细胞浸润，采用密度离心法将淋巴细胞清除密度离心法将淋巴细胞清除，否则癌细胞会被杀死。否则癌细胞会被杀死。5 5. .防止防止与其他细胞株与其他细胞株交叉污染交叉污染。在传代肿瘤细胞培养应注意的问题在传代肿瘤细胞培养应注意的问题1.1.当癌细胞没有生长到足够的量时，当癌细胞没有生长到足够的量时，坚持换液坚持换液，不要急于传代。，不要急于传代。2.2.癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应在传代时采用消化消癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应在传代时采用消化消除法及

30、除法及反复贴壁法反复贴壁法加以清除，分离出癌细胞进行传代培养。加以清除，分离出癌细胞进行传代培养。3.3.在传到在传到1010代前细胞生长繁殖极不稳定，传代要小心。代前细胞生长繁殖极不稳定，传代要小心。4.4.在早期传代时要适当在早期传代时要适当提高接种浓度提高接种浓度。5.5.对于增殖能力极低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些对于增殖能力极低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些促生长促生长物质物质，如胰岛素、氢化考的松、雌激素、，如胰岛素、氢化考的松、雌激素、EGFEGF、软铁蛋白等因子。、软铁蛋白等因子。6.6.消除成纤维细胞消除成纤维细胞始终为癌细胞培养中的重要条件，一旦发现应尽早

31、尽始终为癌细胞培养中的重要条件，一旦发现应尽早尽快按上述介绍的方法加以清除。快按上述介绍的方法加以清除。三三、常用实验技术、常用实验技术1.1.检测细胞的生长和增殖检测细胞的生长和增殖生长曲线生长曲线测定法测定法原理原理：癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期：癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可得一条生长曲线，比时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可得一条生长曲线，比较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长的影响的影响。美蓝法，台盼蓝美蓝法，台盼蓝法法。 制

32、作方法：制作方法：1.1.培养细胞培养细胞 首先在首先在2 2孔孔培养板内分别接种培养板内分别接种相同数量相同数量的细胞。计数并的细胞。计数并记记录接种录接种的细胞悬液之的细胞悬液之密度密度。接种时间记为。接种时间记为0 h0 h。2.2.计数细胞密度计数细胞密度 从接种时间算起，每隔从接种时间算起，每隔24h24h计数计数孔孔内的细胞密度，算出平内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2 23 3次。如此操作至次。如此操作至第七天第七天结束。结束。3.3.绘制曲线绘制曲线 以以培养时间培养时间为为横横坐标、坐标、细胞密度细胞密度为为纵纵坐标

33、，将全部结果在坐坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。培养细胞的生长曲线培养细胞的生长曲线Cell number (104)lg计算药物对细胞的杀伤率、药物对细胞倍增时间影响、药物对细胞生长饱和密度影响四四唑盐（唑盐（MTTMTT）比色法）比色法商品名为噻唑蓝商品名为噻唑蓝原理：原理：活细胞中脱氢酶活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物蓝紫色产物（formazanformazan) )，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（砜（DMSODMSO

34、）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的所含的formazanformazan量成正比。再用酶标仪测定量成正比。再用酶标仪测定ODOD值值MTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等瘤放射敏感性实验等。同类有同类有XTTXTT比色法，比色法， CCK-8 CCK-8比色法比色法。实验过程实验过程1.1.将细胞培养于将细胞培养于9696孔培养板。孔培养板。2.2.按不同实验要求处理细胞。按不同实验要求处理细胞。3.3.每孔加入每孔加入15-2

35、015-20lMTTlMTT液，继续培养液，继续培养3 34h4h。4.4.吸去培养液，每孔加入吸去培养液，每孔加入200200lDMSOlDMSO, ,在微型振荡器振荡在微型振荡器振荡5min,5min,充分充分溶解混匀。溶解混匀。5.5.在在酶标仪酶标仪上测定光吸收。测定波长为上测定光吸收。测定波长为490nm490nm，以只加培养液的的，以只加培养液的的培养皿为培养皿为空白对照空白对照。集落形成试验法集落形成试验法原理：肿瘤细胞系由不同比例原理：肿瘤细胞系由不同比例增殖及分化能力不同的细胞增殖及分化能力不同的细胞组成，其中含组成，其中含有极少部分具有有极少部分具有自我复制和增值能力的干细

36、胞自我复制和增值能力的干细胞，具有分化和形成集落的，具有分化和形成集落的特性，约占特性，约占1%1%，其与肿瘤治愈、复发或转移密切相关。因其具有分化及，其与肿瘤治愈、复发或转移密切相关。因其具有分化及形成集落的能力，故用集落法可体外检测抗癌药物敏感性。形成集落的能力，故用集落法可体外检测抗癌药物敏感性。 做接种率测定时，一般在接种后一周进行检查，每一细胞群数量达做接种率测定时，一般在接种后一周进行检查，每一细胞群数量达8 8或或1010个以上细胞时才能算做一个克隆，用解剖镜检查甚好。个以上细胞时才能算做一个克隆，用解剖镜检查甚好。 2.2.检测细胞检测细胞的侵袭和迁移的侵袭和迁移 划痕实验划痕

37、实验 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。1 1先用先用markermarker笔在笔在6 6孔板背后，用直孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.51cm0.51cm一道，横穿过孔。每孔至一道，横穿过孔。每孔至少穿过少穿过3 3条线。条线。2. 2. 在孔中加入约在孔中加入约5 5105105个细胞，具个细胞，具体数量因细

38、胞种类不同而不同，接体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为种原则为过夜后融合率达到过夜后融合率达到100%100%；3.3.用用10ul 10ul tip tip 枪头用力均匀地在培枪头用力均匀地在培养皿中划痕，养皿中划痕，PBS PBS 洗涤洗涤2 2 次，去除次，去除划下的细胞，加入划下的细胞，加入无血清培养无血清培养基基。4 4放入放入37375%5%CO2CO2培养箱培养。每培养箱培养。每3h 3h 测量一次细胞运动的距离，拍测量一次细胞运动的距离，拍照照( (具体时间依实验需要而定具体时间依实验需要而定) )。趋化运动趋化运动实验实验 趋趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓化运

39、动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。存、生命的繁衍等具有重要的意义。 微孔微孔小室中的趋化实验是根据小室中的趋化实验是根据靶细胞靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够细胞等）能够趋化性主动迁移趋化性主动迁移，穿过一定孔径的，穿过一定孔径的滤膜滤膜而设计的。而设计的。 滤膜滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子（聚碳酸脂膜

40、）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。实验步骤实验步骤1. 1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，于趋化小室的下室，30ml/30ml/孔，每个浓度加孔，每个浓度加3 3 个个孔；孔；2 2. . 取对数生长期细胞取对数生长期细胞，重

41、悬，重悬，调整细胞浓度为调整细胞浓度为5 5105/ml105/ml；3 3. . 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧; ;在上室中加入细胞，在上室中加入细胞，50ml/50ml/孔，每个浓度加孔，每个浓度加3 3 个孔个孔；4. 4. 将趋化小室在将趋化小室在 3737，5% CO2 5% CO2 的孵化箱中孵育的孵化箱中孵育3h3h；5 5. . 在膜的两端加上夹子，毛面在在膜的两端加上夹子，毛面在PBS PBS

42、液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取面在架子上摩擦，再蘸取PBSPBS，反复，反复3 3 次后再蘸取一次，晾干；次后再蘸取一次，晾干；6 6. . 固定固定, , 染色染色scr#1#2#30204060801000110100*EGF(ng/ml)MDA-MB-231CellNumbers/HPF侵袭实验侵袭实验 人工重构基底膜材料人工重构基底膜材料MatrigelMatrigel，是一种，是一种细胞外基质细胞外基质，44时是液体，在时是液体，在37 37 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和蛋白和型胶原

43、，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与构与天然基质膜天然基质膜结构极为相似结构极为相似。滤膜孔径一般为滤膜孔径一般为8mm8mm，而且膜孔都被，而且膜孔都被MatrigelMatrigel覆盖，细胞不覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有种铺有MartrigelMartrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。的滤膜，这与体内情况较为相似。1. 1. 无菌条件下无菌条件下 MatrigelMatrigel 于冰浴融化，用于冰浴融化，用PBSPBS（或（或DMEM

44、only DMEM only 培养基）稀释成培养基）稀释成1mg/ml 1mg/ml 浓度，浓度，-20-20C C 冻存备用；冻存备用；2. 2. 取出已稀释好的取出已稀释好的 MatrigelMatrigel，冰浴融化，以，冰浴融化，以50ml 50ml 的体积铺于的体积铺于TramwellTramwell 小室小室（2424孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），为最好），3737C C 放置放置lhlh，使，使MatrigelMatrigel 聚合成凝胶（注意：加基质胶时最聚合成凝胶（注意：加基质

45、胶时最好将好将24 24 孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；3. 3. 每孔加入每孔加入 200ml 1640200ml 1640（或（或DMEMDMEM）培养基使胶重构；）培养基使胶重构；4. 4. 在在 TranswellTranswell 下室中加入趋化因子或下室中加入趋化因子或10%FBS 10%FBS 培养基培养基600ml/600ml/孔；孔；5. 5. 在上室孔中准确加入细胞在上室孔中准确加入细胞 l l105 105 个个/ /孔，细胞悬液体积孔，细胞悬液体积200ml200ml，置，置于于5%CO2 5%C

46、O2 培养箱于培养箱于3737C C 培养培养24h24h（注意：细胞量和时间根据实验条（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）；件摸索）；6. 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；上未穿过膜的细胞；Transwell小室小室上层培养液上层培养液细胞细胞基质胶基质胶下层培养液下层培养液细胞培养板细胞培养板Transwell侵袭实验侵袭实验示意图示意图7. 4%7. 4%中性甲醛固定中性甲醛固定10 10 分钟，分钟，GiemsaGiemsa 染色染色10 10 分钟，分钟，PBS PBS 洗涤洗涤3 3 次，干次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞(200(200) )；8. 8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取每张膜中央部分和周围部分各随机取 3 3 个视野，计数每个视野内的个视野，计数每个视野内的穿过穿过8mm8mm微孔的细胞数。微孔的细胞数。3.3.检测细胞的致瘤能力检测细胞的致瘤能力成瘤实验成瘤实验无胸腺裸鼠无胸腺裸鼠（Nude MouseNude Mouse，简称