第5单元验证实验

1、第五单元细胞免疫和非特异免疫功能检测技术细胞免疫和非特异免疫功能检测技术 实验一实验一 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 （不连续密度梯度法）（不连续密度梯度法） （验证性实验）（验证性实验）实验目的实验目的v 外周血单个核细胞指淋巴细胞和单核细胞，外周血单个核细胞指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。是免疫学实验中最常用的细胞群。v 在研究免疫细胞时，常常需要先将淋巴细胞在研究免疫细胞时，常常需要先将淋巴细胞等分离纯化，再进一步进行检测。等分离纯化，再进一步进行检测。 v 根据根据各种血细胞的体积、形态、密度和比各种血细胞的体积、形态、密度和比重均有差异，重均有差异

2、，可将不同的细胞分离。可将不同的细胞分离。实验原理实验原理v 不同类别人类血细胞的密度如下：不同类别人类血细胞的密度如下： 多形核白细胞比重多形核白细胞比重 1.092血小板比重约为血小板比重约为 1.032单个核细胞比重为单个核细胞比重为 1.0761.090红细胞比重为红细胞比重为 1.093v利用一种比重介于利用一种比重介于1.0751.092之间等渗的之间等渗的聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合液（）混合液（淋巴细胞分离淋巴细胞分离液液），比重为），比重为 1.0770.001，进行密度梯度离心。，进行密度梯度离心。v离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯

3、度分布。离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。实验原理实验原理n红细胞和多形核粒细胞密度大于分离液，沉于管底；红细胞和多形核粒细胞密度大于分离液，沉于管底；n血小板因密度小而悬浮于血浆中；血小板因密度小而悬浮于血浆中；n单个核细胞的密度略小于分离液，悬浮于分离液上层与单个核细胞的密度略小于分离液，悬浮于分离液上层与血浆层交界处，呈云雾状白膜层。血浆层交界处，呈云雾状白膜层。 血浆血浆 单个核细胞单个核细胞 分离液分离液 粒细胞粒细胞 红细胞红细胞v器材器材: : 试管、滴管、吸管、无菌干燥注射器、无菌棉球、橡皮止试管、滴管、吸管、无菌干燥注射器、无菌棉球、橡皮止血带、水平式离心机、生物显

4、微镜、血细胞计数板等。血带、水平式离心机、生物显微镜、血细胞计数板等。v试剂试剂: 1淋巴细胞分离液（比重淋巴细胞分离液（比重1.077 0.001）。）。 2肝素溶液肝素溶液 用生理盐水配制成用生理盐水配制成500U/ml。 3Hanks液。液。 42g/L台盼蓝染液。台盼蓝染液。 5标本标本 肝素抗凝的人外周静脉血。肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。白细胞稀释液。实验材料实验材料 抗凝全血抗凝全血 缓冲液缓冲液1室温下，将室温下，将2ml抗凝血与抗凝血与2ml Hanks液混合液混合实验方法实验方法2取分离液取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细置入灭菌离心管内，用毛细 吸管将

5、稀释血液吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使沿管壁加入离心管，使 稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液 与稀释血液体积比例为与稀释血液体积比例为1：2）。）。 分离液分离液3配平后将离心管置于水平式离心机内，配平后将离心管置于水平式离心机内， 以以2000r/min 离心离心20min。实验方法实验方法4离心后管内容物从上至下分为四层：离心后管内容物从上至下分为四层：v上层为血浆层上层为血浆层v中层为细胞分离液中层为细胞分离液v下层为红细胞和粒细胞下层为红细胞和粒细胞v上、中层界面处呈现白色浑浊上、中层界面处呈现白色浑浊 即为单个核细胞层。即为单个核

6、细胞层。实验方法实验方法血浆单个核细胞分离液红细胞和粒细胞5. 用吸管插到血浆与分离液的界面处，沿管壁周缘吸出单用吸管插到血浆与分离液的界面处，沿管壁周缘吸出单个核细胞。个核细胞。6. 置入另一离心管中，加入倍体积的置入另一离心管中，加入倍体积的Hanks液混匀，液混匀， 1500 rpm离心离心10min。7. 弃上清，将沉淀细胞振摇重悬后加弃上清，将沉淀细胞振摇重悬后加Hanks液。液。8. 按上述方法洗涤按上述方法洗涤2次。次。 9. 末次离心后，吸尽上清，再加入末次离心后，吸尽上清，再加入Hanks液将细胞悬液体液将细胞悬液体积还原至积还原至1ml。10. 吸取吸取20 l细胞悬液加细

7、胞悬液加380 l白细胞稀释液混匀白细胞稀释液混匀23min。11. 吸取吸取15 l滴入血细胞计数板中，充池计数白细胞数。滴入血细胞计数板中，充池计数白细胞数。实验方法实验方法4个蓝色区域为白细胞计数池个蓝色区域为白细胞计数池v活细胞可排斥染料不被着色，折光性强活细胞可排斥染料不被着色，折光性强v死细胞着蓝色，体积略膨大。死细胞着蓝色，体积略膨大。v正常情况下，活细胞比例大于正常情况下，活细胞比例大于95%。结果判断结果判断1分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密 度要求不同。度要求不同。 人的细胞密度为人的细胞密度为 1.077 0

8、.001。 大鼠为大鼠为 1.088 0.001。 小鼠为小鼠为 1.092 0.001。 兔为兔为 1.096 0.001 等。等。2将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提 高单个核细胞的回收率。高单个核细胞的回收率。注意事项注意事项3向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液 与分离液形成明显界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。与分离液形成明显界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。4为保持淋巴细胞活性，采血后应在为保持淋巴细胞活性，采血后应在2h内分离细胞，尽快内分离细胞，尽快完成操作

9、全程。完成操作全程。5离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，以免影响分离效果。以免影响分离效果。1. 本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要求，若需要进一步进行求，若需要进一步进行T细胞、细胞、B细胞及单核细胞的纯化，细胞及单核细胞的纯化，可考虑采用哪些方法？可考虑采用哪些方法？2. 如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？实验讨论实验讨论福建医科大学福建医科大学 陈敏陈敏实验二实验二 T T淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验（验证性实验）（验证性实验）

10、T淋巴细胞淋巴细胞增殖分化、增殖分化、DNA等大分等大分 子物质合成增加子物质合成增加淋巴母细胞淋巴母细胞刺激物刺激物PHA体积变大体积变大胞浆增多、空泡胞浆增多、空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松基本原理基本原理有丝分裂有丝分裂同位素法同位素法 MTT法法 形态法形态法1 .实验目的实验目的2 .实验原理实验原理3 .试剂与器材试剂与器材4 .操作步骤操作步骤5 .结果判断结果判断6 .注意事项注意事项7 .实验讨论实验讨论教学内容教学内容一、形态学计数法一、形态学计数法实验目的实验目的1. 掌握掌握T淋巴细胞转化试验的原理。淋巴细胞转化试验的原理。2. 熟悉淋巴母细胞的形态特征及

11、判定方法。熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。 T淋巴细胞在有丝分裂原淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。 实验原理实验原理1. RPMIl640 培养液。培养液。 小牛血清小牛血清10%、青霉素、青霉素 100u/m1 、链霉素、链霉素100ug/m1，用无菌，用无菌3% NaHCO3调调pH至至7.27.4。2. 植物血凝素（植物血凝素（P

12、HA）。）。 用含用含10%小牛血清的小牛血清的RPMI培养液稀释至培养液稀释至5001000 g/ml。 3. 姬姆萨染液。姬姆萨染液。4. 标本标本 肝素抗凝人外周静脉血。肝素抗凝人外周静脉血。5. 器材器材 细胞培养瓶、细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。试剂与器材试剂与器材 5%CO2 37 72h1500rpm 离心离心10min染色镜检染色镜检观察细胞形态观察细胞形态PHA无无PHA外周血外周血 0.2ml吸取白细胞层涂片吸取白细胞层涂片操作步骤操作步骤1取肝素抗凝血取肝素抗凝血0

13、.2ml，注入预先加有，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500 g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加，对照瓶内不加PHA。混匀后置。混匀后置37 C、5%CO2培养箱内孵育培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一，期间每天旋转摇匀一次。次。2培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，中，1500rpm 离心离心10min。操作步骤操作步骤 3弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4甲醇固定甲醇固定12min后，姬姆萨染色后，姬姆萨染色152

14、0min，水，水洗，干燥。洗，干燥。 5油镜下计数油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。变化，计算淋巴细胞转化率。淋巴细胞标志及功能检测 龚道科 2002.4未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞结果判断结果判断 未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径m)1220121668核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、14个个有或无有或无无

15、无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率结果判断结果判断 1. 分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密度要求不同。密度要求不同。 如分离人的细胞密度为如分离人的细胞密度为1.077 0.001。 大鼠为大鼠为1.088 0.001。 小鼠为小鼠为1.092 0.001。 兔为兔为1.096 0.001等。等。 2. 将血液稀释

16、后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提高单个核细胞的回收率。提高单个核细胞的回收率。注意事项注意事项3. 向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液与分离液形成明显的界面。注意轻拿轻放，避血液与分离液形成明显的界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。免冲散界面。4. 为保持淋巴细胞活性，采血后应在为保持淋巴细胞活性，采血后应在2h内分离细胞，内分离细胞，尽快完成操作全程。尽快完成操作全程。5. 离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，以免影响分离效果。稳

17、，以免影响分离效果。1. 本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要求，若需要进一步进行的要求，若需要进一步进行T细胞、细胞、B细胞及单核细细胞及单核细胞的纯化，可考虑采用哪些方法？胞的纯化，可考虑采用哪些方法？2. 如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？实验讨论实验讨论二、二、MTT比色法比色法实验目的实验目的： 熟悉熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。的原理及其操作方法。 T淋巴细胞受到淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其胞内作用后发生活化增殖，其胞内线粒体琥珀

18、酸脱氢酶活性相应升高，四甲基噻唑蓝线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成蓝紫色结）作为其底物参与反应，被催化形成蓝紫色结晶甲臢晶甲臢(fomazan) ，经盐酸，经盐酸异丙醇或溶解后为蓝色溶异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活化的程度呈正相关。液。甲臢的形成量与细胞增殖活化的程度呈正相关。 实验原理：实验原理：1. RPMIl640 培养液培养液 。2. 植物血凝素（植物血凝素（PHA）。）。3. 标本标本 肝素抗凝人外周静脉血。肝素抗凝人外周静脉血。4. 器材器材 超净工作台、超净工作台、96孔细胞培养板、孔细胞培养板、 CO2培养

19、培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。联免疫检测仪等。试剂与器材试剂与器材5%CO2 37 68h1500rpm 离心离心10min酶联免疫检测仪酶联免疫检测仪A570nm盐酸异丙醇盐酸异丙醇 100 l/孔孔 操作步骤操作步骤分离外周血分离外周血单个核细胞单个核细胞 1 106/ ml 培养板培养板（含（含PHA） 培养板培养板 （无（无PHA）加入加入MTT 20 l/孔孔 4h100 l/孔孔 1. 先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，并用先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，并用含含10%小牛血清的小牛血清的RPM

20、I 1640培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至1 106/ ml。2. 将细胞悬液加入将细胞悬液加入96孔培养板中，孔培养板中，100 l/孔，每个样品孔，每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔加含三个复孔，并设相应对照孔。实验孔加含50 g/ml的的PHA(终浓度终浓度5 g/ml) 100 l，对照孔加不含，对照孔加不含PHA的的1640培养液培养液100 l。 3. 混匀后置混匀后置37 C、5% CO2培养箱内培养培养箱内培养68h。操作步骤操作步骤4将培养板将培养板1500 rpm离心离心10min，吸弃上清液，每孔，吸弃上清液，每孔 加加MTT 20 l，混匀，继续培养，混

21、匀，继续培养4h后，每孔加后，每孔加100 l 盐酸异丙醇，低速振荡盐酸异丙醇，低速振荡10min。5充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长570nm/ 630nm测定各孔测定各孔A值，测定值为值，测定值为A570nm减去减去630nm 的最终结果。的最终结果。 结果判断结果判断均值对照均值实验刺激指数630nm-570630nm-570A组A组)SI(以刺激指数以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：判断淋巴细胞转化程度：1. 实验过程注意无菌操作，避免细菌污染。实验过程注意无菌操作，避免细菌污染。2. 淋巴细胞要新鲜制备淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后一

22、般在采血后2h内进行实内进行实验。操作时动作要轻柔、迅速，以免损伤细胞。验。操作时动作要轻柔、迅速，以免损伤细胞。3. 加入盐酸异丙醇后要在加入盐酸异丙醇后要在30 min内进行测定，若规内进行测定，若规定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培养板置养板置4 C保存。测定前取出，室温静置保存。测定前取出，室温静置10min后再加盐酸异丙醇。后再加盐酸异丙醇。注意事项注意事项1. 试讨论试讨论MTT比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取

23、哪些措施可减少实验误差，使结果可信？哪些措施可减少实验误差，使结果可信？实验讨论实验讨论福建医科大学福建医科大学 陈敏陈敏实验三实验三 细胞吞噬率与细胞吞噬率与 吞噬指数测定吞噬指数测定 （验证性实验）（验证性实验）v 实验目的实验目的v 实验原理实验原理v 试剂与器材试剂与器材v 操作步骤操作步骤v 结果判断结果判断v 注意事项注意事项v 实验讨论实验讨论教学内容教学内容一、中性粒细胞吞噬功能测定一、中性粒细胞吞噬功能测定 观察细胞吞噬现象，熟悉中性粒细胞吞观察细胞吞噬现象，熟悉中性粒细胞吞噬作用的原理和检测方法。噬作用的原理和检测方法。 实验目的实验目的 根据中性粒细胞具有吞噬功能，将吞噬

24、细根据中性粒细胞具有吞噬功能，将吞噬细胞与细菌等颗粒性异物混合孵育一定时间后，胞与细菌等颗粒性异物混合孵育一定时间后，推片、染色，于油镜下观察细胞吞噬细菌的情推片、染色，于油镜下观察细胞吞噬细菌的情况，计算吞噬率和吞噬指数。况，计算吞噬率和吞噬指数。实验原理实验原理1白色葡萄球菌悬液白色葡萄球菌悬液 浓度浓度5108/ml，置，置4备用。备用。2肝素抗凝管肝素抗凝管(含含20U/ml肝素肝素20l)。3Hanks液。液。4. 瑞氏染液、瑞氏染液、75%酒精、碘酒、香柏油。酒精、碘酒、香柏油。5. 器材器材 水浴箱、水浴箱、37温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、试温箱、显微镜、滴管、一次性采血针

25、、试管、玻片、微量移液器、无菌干棉球、洗耳球、接种环等。管、玻片、微量移液器、无菌干棉球、洗耳球、接种环等。试剂与器材试剂与器材 操作步骤操作步骤全血与菌全血与菌液混匀液混匀1. 用碘酒和酒精棉球先后消毒采血针用碘酒和酒精棉球先后消毒采血针和无名指。和无名指。2. 用一次性采血针刺破消毒部位皮肤，用一次性采血针刺破消毒部位皮肤，取取40l血加入肝素抗凝管中。血加入肝素抗凝管中。3. 用滴管取一滴菌液加入血试管中，用滴管取一滴菌液加入血试管中，轻摇混匀。轻摇混匀。4. 取轻轻取出试管，用微量移液器从试管底部细胞层吸取轻轻取出试管，用微量移液器从试管底部细胞层吸取取5l于载玻片上，用另一载玻片推成

26、薄血片，晾干。于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片，晾干。5. 将瑞氏染液滴于上述血片，先染将瑞氏染液滴于上述血片，先染3060s。然后加等量。然后加等量蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染1015 min.6. 水洗，晾干后油镜下观察。水洗，晾干后油镜下观察。 中性粒细胞吞噬时，可见细胞核与被吞噬的细菌均染中性粒细胞吞噬时，可见细胞核与被吞噬的细菌均染成紫色，而细胞浆则为淡红色。成紫色，而细胞浆则为淡红色。结果判断结果判断结果判断结果判断菌的细胞数个中性粒细胞中吞噬细吞噬率100 200200 200200的总数个中性粒细胞吞噬细菌吞噬指数1. 所用器材要洁净、无油

27、污。所用器材要洁净、无油污。2. 白色葡萄球菌悬液中若含有白色葡萄球菌悬液中若含有10%的小牛血清，可提高吞的小牛血清，可提高吞噬率和吞噬指数。噬率和吞噬指数。3. 吞噬细菌的中性粒细胞往往在血片的尾部较多，因此计吞噬细菌的中性粒细胞往往在血片的尾部较多，因此计数时应取血片的前、中、后三段计数，以减少实验误差。数时应取血片的前、中、后三段计数，以减少实验误差。 注意事项注意事项1. 中性粒细胞吞噬细菌时，有时难以计数吞入的细菌颗粒。中性粒细胞吞噬细菌时，有时难以计数吞入的细菌颗粒。试讨论可从哪些方面改进实验，方便计算吞噬率和吞噬试讨论可从哪些方面改进实验，方便计算吞噬率和吞噬指数？指数？2.

28、在实验过程中应注意哪些事项可减少实验误差？在实验过程中应注意哪些事项可减少实验误差？ 实验讨论实验讨论二、巨噬细胞吞噬功能测定二、巨噬细胞吞噬功能测定 熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。 了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。 实验目的实验目的 巨噬细胞具有很强的吞噬异物及细菌的功能，巨噬细胞具有很强的吞噬异物及细菌的功能，在体内外均能吞噬颗粒物质。将巨噬细胞与鸡在体内外均能吞噬颗粒物质。将巨噬细胞与鸡红细胞（红细胞（CRBC）混合后孵育一定时间后，观察）混合后孵育一定时间后，观察巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬CRBC的百分率和吞噬

29、指数，可了的百分率和吞噬指数，可了解其吞噬功能。解其吞噬功能。实验原理实验原理1. 实验动物实验动物 昆明种小白鼠，昆明种小白鼠，7周龄左右，体重周龄左右，体重1822g，雌雄，雌雄不限。不限。2. 5%淀粉肉汤。淀粉肉汤。3. 2% 鸡红细胞（鸡红细胞（CRBC）悬液。）悬液。4. 瑞氏染液、瑞氏染液、75%酒精、碘酒、香柏油。酒精、碘酒、香柏油。5. 器材器材 一次性注射器、有齿镊、吸管、手术剪、解剖盘、一次性注射器、有齿镊、吸管、手术剪、解剖盘、试管、恒温水浴箱、试管、恒温水浴箱、 玻片、离心机、显微镜等。玻片、离心机、显微镜等。试剂与器材试剂与器材 操作步骤操作步骤1在实验前在实验前3

30、d，自小鼠腹腔注射，自小鼠腹腔注射 5淀粉肉汤溶液淀粉肉汤溶液1ml/只，以只，以 诱导巨噬细胞游离至腹腔。诱导巨噬细胞游离至腹腔。2实验时，经腹腔给小鼠注射实验时，经腹腔给小鼠注射 2鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液lml，轻揉，轻揉 小鼠腹部，使悬液分散。小鼠腹部，使悬液分散。3. 30 min后，麻醉处死小鼠。后，麻醉处死小鼠。4. 将小鼠置于解剖盘中，将小鼠置于解剖盘中，常规消毒后，先剪开腹常规消毒后，先剪开腹部皮肤，然后提起腹壁部皮肤，然后提起腹壁斜剪一小口，用不装针斜剪一小口，用不装针头的注射器或吸管吸取头的注射器或吸管吸取腹腔液。腹腔液。 5. 将收集的腹腔液置于离心管中，以将收集的腹腔

31、液置于离心管中，以1500rpm 离心离心10min。6. 弃上清，吸取沉淀细胞涂片，待自然干燥。弃上清，吸取沉淀细胞涂片，待自然干燥。7. 将瑞氏染液滴于上述涂片，先染将瑞氏染液滴于上述涂片，先染3060s。然后加等量。然后加等量 蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染1015 min，水，水 洗，晾干后油镜下观察。洗，晾干后油镜下观察。 油镜下可见圆形或不规则形状核呈蓝紫色的巨噬细胞，油镜下可见圆形或不规则形状核呈蓝紫色的巨噬细胞，CRBC多为椭圆形胞浆呈淡紫红色有核的细胞。多为椭圆形胞浆呈淡紫红色有核的细胞。 结果判断结果判断 被吞噬消化的鸡红细胞核模糊，核肿胀

32、，染色淡，被吞噬消化的鸡红细胞核模糊，核肿胀，染色淡，胞质浅染，胞核呈浅灰黄色。胞质浅染，胞核呈浅灰黄色。结果判断结果判断1. 腹腔注射腹腔注射CRBC后，要注意掌握好吞噬作用时间。后，要注意掌握好吞噬作用时间。 时间太长时间太长CRBC可被消化，时间过短则尚未被吞噬。可被消化，时间过短则尚未被吞噬。2. 剪开小鼠腹腔吸取腹腔液时应避免出血，否则将影响剪开小鼠腹腔吸取腹腔液时应避免出血，否则将影响试验结果。试验结果。3. 涂片的薄厚要适当，否则将影响结果观察。涂片的薄厚要适当，否则将影响结果观察。注意事项注意事项1. 为何在实验前为何在实验前3d要给小白鼠腹腔注射要给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉淀

33、粉肉 汤，有何作用？汤，有何作用？2. 临床上若需要检测巨噬细胞功能，应如何采集临床上若需要检测巨噬细胞功能，应如何采集 人巨噬细胞？人巨噬细胞？实验讨论：实验讨论：福建医科大学福建医科大学 陈敏陈敏实验四实验四 血清总补体活性测定血清总补体活性测定 （验证性实验）（验证性实验）v 实验目的实验目的v 实验原理实验原理v 试剂与器材试剂与器材 v 操作步骤操作步骤v 结果判断结果判断v 注意事项注意事项v 实验讨论实验讨论教学内容：教学内容： 观察血清补体介导的溶血现象，了解补观察血清补体介导的溶血现象，了解补体系统在免疫反应过程中的效应作用。体系统在免疫反应过程中的效应作用。实验目的实验目的

34、 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）与相应抗体（溶血）与相应抗体（溶血素）结合形成的致敏红细胞可通过经典活化途素）结合形成的致敏红细胞可通过经典活化途径激活补体，从而导致径激活补体，从而导致SRBC溶解。当红细胞溶解。当红细胞与溶血素的浓度恒定时，在规定的反应时间内，与溶血素的浓度恒定时，在规定的反应时间内，补体的量及其活性与溶血程度正相关。补体的量及其活性与溶血程度正相关。实验原理实验原理溶血程度与补体含量的关系溶血程度与补体含量的关系 由于溶血程度在由于溶血程度在30%70% 时，补体的用时，补体的用量稍有变化就会对溶血程量稍有变化就会对溶血程度产生很大的影响，所以度产生很大的影响，所以通

35、常以通常以50%溶血程度溶血程度（CH50）作为判定反应终）作为判定反应终点的指标，而不用点的指标，而不用100%溶溶血程度。血程度。1. 巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（BBS，pH7.4）。）。2. 2%SRBC悬液悬液 。3. 溶血素（抗溶血素（抗SRBC抗体）抗体） 按效价用按效价用BBS稀释至稀释至2个单位。个单位。4. 待检血清、生理盐水、待检血清、生理盐水、17g/L高渗盐水。高渗盐水。5. 器材器材 离心机、试管、刻度吸管、恒温水浴箱、离心机、试管、刻度吸管、恒温水浴箱、721分光光分光光 度计、比色杯等。度计、比色杯等。 试剂与器材试剂与器材 操作步骤：操作步骤： 1. 稀释待检

36、血清稀释待检血清 吸取新鲜待检血清吸取新鲜待检血清0.2ml， 加入加入BBS3.8ml，将血清进行，将血清进行1:20稀释。稀释。2. 制备制备50%溶血标准管溶血标准管 吸取吸取2%SRBC悬液悬液0.5ml，加蒸馏水，加蒸馏水2.0ml，混匀使红细胞全部溶解，为，混匀使红细胞全部溶解，为100%溶血管；加入溶血管；加入17g/L高渗盐水高渗盐水2.0ml使之成为等渗溶液，再加入使之成为等渗溶液，再加入2%SRBC悬液悬液0.5ml，即成为，即成为50%溶血管。溶血管。3. 取试管取试管10支按顺序编号，然后按照下表所示加入各试剂，将各管混匀，支按顺序编号，然后按照下表所示加入各试剂，将各

37、管混匀，置置37水浴水浴30min后测定补体活性。后测定补体活性。试管号试管号BBS缓冲液缓冲液（ml） 1:20稀释血清稀释血清（ml） 2%SRBC（ml） 2U溶血素溶血素（ml） 补体溶血活性补体溶血活性 （U/ml）1 1.400.100.5 0.5 37 水浴 30 min2002 1.350.150.5 0.51333 1.300.200.5 0.51004 1.250.250.5 0.5805 1.200.300.5 0.566.66 1.150.350.5 0.557.17 1.100.400.5 0.5508 1.050.450.5 0.544.49 1.000.500.5

38、 0.54010 1.500.000.5 0.5-结果判断结果判断4.将各反应管经将各反应管经2500 r/min离心离心5min分光光度计波长分光光度计波长542nm比色比色血清总补体活性（血清总补体活性（CH50 U/ml）1/血清用量血清用量(ml)血清稀释倍数血清稀释倍数选择溶血程度与标准管最接近的管选择溶血程度与标准管最接近的管1. 待检血清应无溶血、无污染、无乳糜血。待检血清应无溶血、无污染、无乳糜血。2. 待检血清必须新鲜，如放置室温待检血清必须新鲜，如放置室温2h以上，可使补体活性以上，可使补体活性下降。下降。3. 补体性质不稳定，其溶血活性可受多种因素的影响，因补体性质不稳定

39、，其溶血活性可受多种因素的影响，因此，缓冲液、绵羊红细胞等试剂应新鲜配制，所用实验此，缓冲液、绵羊红细胞等试剂应新鲜配制，所用实验器材应清洁，残留的酸碱等化学物质均可使补体受破坏。器材应清洁，残留的酸碱等化学物质均可使补体受破坏。注意事项注意事项4. 绵羊红细胞浓度和溶血素的量应尽可能准确。否则可直接影绵羊红细胞浓度和溶血素的量应尽可能准确。否则可直接影响溶血程度。响溶血程度。 当用高浓度溶血素致敏时，溶血程度则随红细胞浓度的增当用高浓度溶血素致敏时，溶血程度则随红细胞浓度的增 加而增加。加而增加。 红细胞浓度增加一倍，可使红细胞浓度增加一倍，可使50%溶血补体量增加溶血补体量增加25%左右。

40、左右。注意事项注意事项1. 补体的溶血活性为何以补体的溶血活性为何以50%溶血程度（溶血程度（CH50） 作为判定反应终点的指标，而不用作为判定反应终点的指标，而不用100%溶血溶血程度？程度？2. 哪些因素可造成哪些因素可造成CH50结果发生偏差？结果发生偏差？实验讨论实验讨论福建医科大学福建医科大学 陈敏陈敏白细胞杀菌能力测定白细胞杀菌能力测定 （设计性实验（设计性实验 ）v实验目的实验目的v实验基本原理及背景知识实验基本原理及背景知识 v设计性实验要求设计性实验要求 v实验设计策略实验设计策略 v实验注意要点实验注意要点 v设计方案的总结和讨论设计方案的总结和讨论教学内容教学内容v 自主

41、设计并完成实验全过程自主设计并完成实验全过程v 观察白细胞的吞噬功能及其代谢变化观察白细胞的吞噬功能及其代谢变化v 熟悉与白细胞杀菌能力相关的指标熟悉与白细胞杀菌能力相关的指标v 学会分析并探讨胞内杀菌机制学会分析并探讨胞内杀菌机制实验目的实验目的 吞噬细胞可通过趋化、调理、吞噬和杀伤等步骤清吞噬细胞可通过趋化、调理、吞噬和杀伤等步骤清除病原体、死亡细胞等异物，是机体非特异免疫的重要除病原体、死亡细胞等异物，是机体非特异免疫的重要组成部分。组成部分。 与细胞吞噬过程相关的趋化、吞噬、呼吸爆发、脱与细胞吞噬过程相关的趋化、吞噬、呼吸爆发、脱颗粒等任何阶段功能缺陷均可影响吞噬细胞的杀菌活性。颗粒等

42、任何阶段功能缺陷均可影响吞噬细胞的杀菌活性。实验基本原理及背景知识实验基本原理及背景知识白细胞杀菌能力的检测方法：白细胞杀菌能力的检测方法： 1. NBT还原试验还原试验 2. 细菌计数法细菌计数法 3. 化学发光法化学发光法实验基本原理及背景知识实验基本原理及背景知识 根据实验目的、基本原理以及所提供的实验条件根据实验目的、基本原理以及所提供的实验条件,自自主设计主设计12种检测白细胞杀菌功能的实验方案。种检测白细胞杀菌功能的实验方案。 阐明实验原理、观察指标、操作步骤和实验的注意阐明实验原理、观察指标、操作步骤和实验的注意事项。按最佳实验设计方案完成实验全过程，完成实验事项。按最佳实验设计

43、方案完成实验全过程，完成实验报告，并进行结果分析与总结。报告，并进行结果分析与总结。实验要求实验要求1. NBT还原试验还原试验设计策略设计策略 当细菌感染时，中性粒细胞在吞噬杀菌过程中发生当细菌感染时，中性粒细胞在吞噬杀菌过程中发生呼吸爆发，糖代谢活性增强。此时，被吞噬进入胞质内呼吸爆发，糖代谢活性增强。此时，被吞噬进入胞质内淡黄色的淡黄色的NBT，可被细胞糖氧化过程中所脱的氢还原成，可被细胞糖氧化过程中所脱的氢还原成蓝紫色的甲臜蓝紫色的甲臜(formazan)，以折光性很强的点状或斑块，以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于胞浆内。在镜下检测状颗粒沉积于胞浆内。在镜下检测NBT阳性细胞数量，

44、阳性细胞数量，可推知中性粒细胞的杀菌功能。可推知中性粒细胞的杀菌功能。2. 细菌计数法细菌计数法设计策略设计策略 将一定量的白细胞与细菌按比例混合、培养。作将一定量的白细胞与细菌按比例混合、培养。作用一段时间之后，在培养体系中加入抗生素杀死胞外用一段时间之后，在培养体系中加入抗生素杀死胞外细菌，而吞入胞内的细菌则不被抗生素杀灭。定时取细菌，而吞入胞内的细菌则不被抗生素杀灭。定时取样，将白细胞溶解，释放出胞内细菌进行培养，计数样，将白细胞溶解，释放出胞内细菌进行培养，计数生长的菌落即可直接判断中性粒细胞的杀菌功能。生长的菌落即可直接判断中性粒细胞的杀菌功能。 3. 化学发光法化学发光法设计策略设

45、计策略 当中性粒细胞在吞噬细菌过程中，随着呼吸爆发，当中性粒细胞在吞噬细菌过程中，随着呼吸爆发，产生大量活性氧代谢产物，包括过氧化氢、超氧阴离产生大量活性氧代谢产物，包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基等，后者又能激发细胞内某些物质产生子、羟自由基等，后者又能激发细胞内某些物质产生化学发光反应，细胞的杀菌能力与发光强度相平行。化学发光反应，细胞的杀菌能力与发光强度相平行。因此可通过化学发光仪测量发光信号，从而推算细胞因此可通过化学发光仪测量发光信号，从而推算细胞吞噬杀菌功能。吞噬杀菌功能。1. 实验用的无菌试管、离心管、吸管等应使用硅油处理，以实验用的无菌试管、离心管、吸管等应使用硅油处理，以防

46、止细菌和白细胞黏附。防止细菌和白细胞黏附。2. 要设实验对照，以排除因细胞溶解或其他原因释放的酶所要设实验对照，以排除因细胞溶解或其他原因释放的酶所引起的非特异性反应。引起的非特异性反应。 3. NBT还原与被吞噬过程在时间上是一致的，因此要注意控还原与被吞噬过程在时间上是一致的，因此要注意控制白细胞与染料的时间制白细胞与染料的时间(30min)，以便得到准确的结果。，以便得到准确的结果。 注意要点注意要点4. NBT染料在盐水中不易溶解，故配制染料在盐水中不易溶解，故配制NBT原液时要过滤去原液时要过滤去除未溶解的除未溶解的NBT颗粒，否则将被吞噬细胞吞噬，从而影响颗粒，否则将被吞噬细胞吞噬

47、，从而影响试验结果。试验结果。 5. 发光剂要注意发光剂要注意4、避光保存。、避光保存。注意要点注意要点vNBT还原试验是临床上常用的检测的方法。具有操作简还原试验是临床上常用的检测的方法。具有操作简单、快速等优点，但特异性差，影响因素多，容易出现单、快速等优点，但特异性差，影响因素多，容易出现假阴性或假阳性。假阴性或假阳性。v试讨论试讨论NBT试验的原理及其临床意义。试验的原理及其临床意义。总结和讨论总结和讨论v细菌计数法是检测中性粒细胞胞内杀菌能力的最直接细菌计数法是检测中性粒细胞胞内杀菌能力的最直接方法，可用于诊断慢性肉芽肿、髓过氧化物酶缺陷症方法，可用于诊断慢性肉芽肿、髓过氧化物酶缺陷

48、症等中性粒细胞杀菌功能缺陷病。但该法操作麻烦、费等中性粒细胞杀菌功能缺陷病。但该法操作麻烦、费时，临床较少应用。时，临床较少应用。v 化学发光法可在生理温度和中性环境下测定，能较好化学发光法可在生理温度和中性环境下测定，能较好地反映生理条件下吞噬细胞的功能，具有准确灵敏、地反映生理条件下吞噬细胞的功能，具有准确灵敏、简便快速等优点。其敏感性高于简便快速等优点。其敏感性高于NBT还原试验。还原试验。福建医科大学福建医科大学 陈敏陈敏流式细胞分析系统流式细胞分析系统 （临床见习（临床见习 ） 流式细胞分析：流式细胞分析： 是以流式细胞仪（是以流式细胞仪（FCMFCM）为检测手段的一种）为检测手段的

49、一种能高速精确地对单个细胞的理化及生物学特性进能高速精确地对单个细胞的理化及生物学特性进行多参数定量分析的先进技术。行多参数定量分析的先进技术。 特点：特点： 单个细胞分析单个细胞分析 速度快速度快 多参数多参数 灵敏度高灵敏度高 准确性好准确性好临床分析型临床分析型流式细胞仪流式细胞仪 综合综合 (分选分选)型型v实验目的实验目的v基本原理基本原理v见习内容见习内容 v见习报告见习报告教学内容教学内容v熟悉熟悉FCMFCM的工作原理和技术流程。的工作原理和技术流程。v了解了解FCMFCM在血液学、细胞遗传学、肿瘤生物学等在血液学、细胞遗传学、肿瘤生物学等学科中的应用。学科中的应用。实验目的实

50、验目的基本原理基本原理 FCM在荧光标在荧光标记探针协助下，对记探针协助下，对悬浮的单个细胞或悬浮的单个细胞或微粒表面或内部的微粒表面或内部的化学成分特性进行化学成分特性进行快速分析或纯化分快速分析或纯化分选。选。 v 先制备待测的单细胞悬液，先制备待测的单细胞悬液，经过荧光抗体标记后，让待经过荧光抗体标记后，让待测细胞在气体压力的驱动下测细胞在气体压力的驱动下流经充满鞘流的流动室。细流经充满鞘流的流动室。细胞排成单列逐个依次通过激胞排成单列逐个依次通过激光检测区。光检测区。v 被荧光染色的细胞在垂直入被荧光染色的细胞在垂直入射的激光束照射下，产生了射的激光束照射下，产生了细胞的散射光信号和特

51、定波细胞的散射光信号和特定波长的荧光信号。长的荧光信号。 通过不同的检测器和特定波长选择通透性的滤光片，通过不同的检测器和特定波长选择通透性的滤光片，可获得不同方向的散射光和不同波长的荧光信号来，经可获得不同方向的散射光和不同波长的荧光信号来，经过一系列的的光电倍增管放大后，由计算机系统收集、过一系列的的光电倍增管放大后，由计算机系统收集、数字化处理，最后通过计算机软件分析结果。数字化处理，最后通过计算机软件分析结果。 基本原理基本原理 单细胞液流柱单细胞液流柱 流动室振动流动室振动 液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴废液容器废液容器 偏转落入收集器偏转落入收

52、集器超声压电晶体超声压电晶体高频振动高频振动 不充电不充电充电充电 细胞分选是通过细胞分选是通过分离含有单细胞的液分离含有单细胞的液滴而实现的。滴而实现的。 v FCM的结构及主要部件的结构及主要部件 v 样品制备样品制备 v 免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法 v 技术流程技术流程 v 质量控制质量控制 v 设备维护设备维护 v 结果判定结果判定 见习内容见习内容 流式细胞仪流式细胞仪目前临床型流式细胞仪主要有目前临床型流式细胞仪主要有FACS Calibur、EPICS XL和和Cytomics FC500，两家公司的仪器在两家公司的仪器在使用上有所不同使用上有所不同 。EPICS XLCy

53、tomics FC500FACS Calibur1. 液流系统液流系统 2. 光学系统光学系统3. 计算机控制系统计算机控制系统 FCM的基本结构及部件的基本结构及部件喷嘴喷嘴 荧光信号荧光信号 激光束激光束鞘液鞘液液流系统液流系统FCMFCM的液流系统（如何形的液流系统（如何形成单个细胞流）成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管FS前向角散前向角散射光检测器射光检测器SS侧向角散侧向角散射光检测器射光检测器FL1FL1荧光检测器荧光检测器液滴液滴激光束激光束光学系统光学系统FL2FL2荧光检测器荧光检测器FL3FL3荧光检测器荧光检测器FL4FL4荧光检测器荧光检测器散射光信号散射光信号:

54、FS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度荧光信号荧光信号FL1-FL4 ： 反映细胞或颗粒上荧光量的多少反映细胞或颗粒上荧光量的多少数据参数数据参数 主要由计算机数据处理及分析软件组成，可进行实主要由计算机数据处理及分析软件组成，可进行实验数据的分析、存储与显示。验数据的分析、存储与显示。 计算机控制系统计算机控制系统单参数直方图单参数直方图双参数散点图双参数散点图 二维等高图二维等高图假三维等高图假三维等高图数据显示方式数据显示方式数据显示方式数据显示方式三参数散点图三参数散点图单参数直方图：单参数直方图：由一维参数由一维参数(散射光

55、散射光或荧光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成。横构成。横轴为该参数测量强轴为该参数测量强度相对值，单位是度相对值，单位是道数。纵轴一般是道数。纵轴一般是细胞数或细胞出现细胞数或细胞出现的频数。的频数。数据显示方式数据显示方式双参数散点图：双参数散点图：X轴代表第一个测量参数轴代表第一个测量参数Y轴代表第二个测量参数轴代表第二个测量参数每个点代表一个细胞每个点代表一个细胞数据显示方式数据显示方式二维等高图：二维等高图：用等高线来表示细胞数用等高线来表示细胞数在一条等高线上细胞数相同在一条等高线上细胞数相同不同的等高线上细胞数不同不同的等高线上细胞数不同数据显示方式数据显示方式假三维

56、等高图：假三维等高图：纵轴与横轴分别代表被纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数测细胞的两个测量参数, ,Z Z轴为细胞数。轴为细胞数。数据显示方式数据显示方式FSSS三参数散点图：三参数散点图：三维坐标均为参数三维坐标均为参数（散射光或荧光）（散射光或荧光）而非细胞数。而非细胞数。数据显示方式数据显示方式FSCD45-FITCCD34-PEGate设置：设置： 指在某张选定参数的直方图上，根据其细胞群分指在某张选定参数的直方图上，根据其细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并使该样本所有布选定其中想要分析的特定细胞群，并使该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。其他参数组

57、合的直方图只体现这群细胞的分布情况。设门分析技术设门分析技术线性门线性门矩形门矩形门圆形门圆形门十字门十字门 多边形门多边形门任意形状门任意形状门设门分析技术设门分析技术根据门的形状分为：根据门的形状分为：外周血外周血骨髓骨髓组织块组织块培养细胞培养细胞脱落细胞脱落细胞。常用抗凝剂：常用抗凝剂：EDTA： 2mg/ml枸椽酸钠：枸椽酸钠：0.38%肝素：肝素：15IU/ml样品制备样品制备 标本来源：标本来源：v 标本浓度：标本浓度： v 单细胞悬液：单细胞悬液：106个个ml荧光素在流式细胞仪上的检测通道荧光素在流式细胞仪上的检测通道 FITC，GFP，Alexa Fluor 488， YF

58、P, CFSE, Vybrant Green，PKH67 PE，YFP, PKH26, DsRed, Vybrant orange, PI PE-Texas Red，PE-Cy5，PerCP，PerCP-Cy5.5 ，PE-Cy7APC，Alexa 647FL1FL2FL3FL4常用的荧光染料常用的荧光染料常用的荧光染料常用的荧光染料FITC，AlexaFluor 488, GFP, YFP, CFSE, Vybrant Green，PKH67 PE，YFP, PKH26, DsRed, Vybrant orange, PI ECD, PI, AlexaFluor 594, PE-AF610

59、PE-Cy5 , PerCP 7-AADFL1FL2FL3FL4PE-Cy7FL5BD FACSCalibur的荧光通道的荧光通道Beckman Coulter Cytomics FC500的荧光通道的荧光通道技术流程技术流程 （1）分别将鞘液盒及清洁液盒加满，废液桶倒净。）分别将鞘液盒及清洁液盒加满，废液桶倒净。 （2）依次开启总电源、计算机、显示屏。）依次开启总电源、计算机、显示屏。 （3）打开电源箱门，检查：）打开电源箱门，检查：WATER TRAP液体不能超过液体不能超过1/3VACUUM TRAP液体不能超过液体不能超过1/4AIRFILTER与与VACUUM FILTER必需干燥无

60、水必需干燥无水1.开机程序开机程序技术流程技术流程 （4）检查）检查SYSTEM VACUUM表，负压应在表，负压应在-1730in.Hg之间。之间。（5）检查）检查SYSTEM PRESURE 表，调节压力为表，调节压力为2832PSI 之间。之间。（6）确认仪器）确认仪器LASER ON 灯亮。灯亮。 （7）确认仪器启动）确认仪器启动1030min后后READY灯亮（绿色）。灯亮（绿色）。 （8）确保）确保LASER HEAD 的风冷气流通畅。的风冷气流通畅。 1.开机程序开机程序技术流程技术流程 （9）检查样品进样头有负压。）检查样品进样头有负压。 (10) 确认计算机屏幕无显示异常的报