低分子量肝素对E

1、低分子量肝素对 E 选择素介导的 HL 60 细胞与 血管内皮细胞黏附的影响作者：宋宝辉张晓莉付德才【摘要】目的 研究低分子量肝素（LMW）对 E 选择素介导的 HL 60 细胞与血管内皮细胞黏附的影响。方法 通过原代培养方法分离人脐静脉内皮细胞（HUVE）并建立体外模拟毛细血管流动的层流体系，利用该体系观察LMW 对体外动态条件下 HL 60 细胞与 TNFa诱导的 HUVEC 的黏附作用的影 响，荧光读板仪测定 LMW 对 E 选择素表达的影响。结果 TNFa处理 HUVEC 5 h 能明显增加 HL 60细胞与 HUVEC 在动态条件下黏附，并能明显 促进 HUVEC 表面 E 选择素表

2、达。0.1、1 mg/ml 对 HL 60 细胞体外黏附有 明显抑制作用；0.01、0.1、1 mg/ml 对脐静脉内皮E 选择素的表达有明显抑 制作用。结论 LMWH 有明显抑制体外动态条件下 HL 60 细胞与人脐静脉内皮 细胞黏附及降低血管内皮细胞 E 选择素表达的作用。这一结果为LMW 作为 抗炎药物， 尤其是为以选择素作为药物作用靶点应用于临床提供了重要的实验 基础。【关键词】低分子量肝素；细胞黏附；人脐静脉内皮细胞；E 选择素细胞黏附是机体的重要生理现象，而白细胞与血管内皮细胞的黏附对维持 机体正常活动以及介导炎症发生具有重要作用13。血流状态下的白细胞 黏附是一个多步骤的复杂的级

3、联反应过程，多种黏附分子家族参与了这一过 程。其中，选择素家族主要在白细胞起始黏附阶段发挥作用。由于选择素的重 要作用，以选择素为靶点的抗黏附治疗已成为当前治疗非特异性炎症的研究热 点 4 。 低分子量肝素（low molecularweight heparin ，LMWH）是近年来发 展起来的一类新型生化药物，是由肝素分级或降解而成的低分子量的组分或片 段，分子量一般为 3 0008 000。已有的研究表明，LMWr 可抑制中性粒细胞 与血管内皮细胞的黏附，但相关分子机制有待深入研究57。本实验在体 外动态条件下，研究 LMWH 寸 E 选择素介导的白细胞起始黏附的影响，为LMWH 应用于临

4、床提供依据。1 材料与方法1.1材料IMDM RPMI 1640 培养基（美国 Gibco），低分子量肝素钠注射液 40 mg/0.4 ml（法国 AVENTIS Pharma Specialites）, 胎牛血清（杭州四季青），1型 胶原酶、凝血酶（美国 Sigma），急性髓性白血病细胞系（HL 60）由本室保存， 96 和 48 孔细胞培养板（美国 Costar） ， 塑料培养瓶 （美国 Corning ） ， 荧光 读板仪 （GE Healthcare ） ，倒置显微镜（日本 Nik on ）, CO2 恒温培养箱（美 国 Nuaire），彩色视频摄像装置（日本 Panasonic ），

5、平行板流动小室（美国 GlycoTech），人 PECAM 1 单抗，人VE cadheri 单抗（美国 eBioscienee） ， E 选择素阻断性单抗（美国 Santa Cruz ），10-09-07 14:35:00 编辑：studa其他试剂均为国 产分析纯。1.2方法1.2.1细胞培养HL 60 细胞培养于含 10 %胎牛血清、19 青霉素、1%链霉素的 RPMI 1640 培养基中，置于 37C5%CO 的细胞培养箱中培养。人脐静脉内皮细胞（HUVEC 原代培养按 Jaffe 等8的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿 脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻

6、璃管 结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用 37rPBS（0.01 mol/L，pH7.6）冲洗 2 次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌 注 0.1 %胶原酶混合消化液 810 ml 使血管充盈，夹闭胶管放入已灭菌的大平 皿中。37E孵育 15 min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促 使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白 酶注入 50 ml 锥形离心管中，加入胎牛血清 2 ml终止酶反应。再以 30 ml PBS 冲洗管腔,流出液倒入离心管,1 000 r/min 离心 10 min ,弃上清，加入含有 10 %

7、胎牛血清的 IMDM 培养液,充分混合制成细胞悬液。取 0.1 ml细胞悬液在 血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1X105/ml 接种至塑料培养瓶，置于5%CO237C静止培养 12 h 更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2 d换液 1 次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。 PECAM 1 和 VE cadheri 免 疫荧光染色鉴定呈阳性，取 3 代细胞用于实验。1.2.2体外模拟毛细血管的层流实验用体外模拟毛细血管的层流实验测定 HL 60 细胞与 HUVE 黏附作用。所 有用于层流实验的单细胞悬液密度均为 1X106 个/ml，HUVE 单层用 TNFa（20 ng/ml ）刺激

8、 5 h 使之表达高水平的 E 选择素。将覆盖有 HUVEC 勺 35 mm 培养皿装配于平行板流动小室，然后放置在倒置显微镜的载物台上。倒置显 微镜连接有彩色视频摄像装置，可以将视频图像传送到录像机，并可用相连的 计算机显示器同步观察。首先用注射泵注入PBS（0.1% BSA 冲洗平行板流动小室约 2 min，然后以 1.0 dyn/cm2 流速注入 HL 60 细胞单细胞悬液，整个 系统保持在 22E。当 HL 60 细胞进入视野 3 min 后，随机选定 1020 个区 域（10 倍），记录黏附于 HUVC 单层的白细胞，最后通过观看录像人工计数。 在抗体阻断、LMWF 抑制的实验中，细胞先与 mAb（20 卩 g/ml ）及不同浓度的 LMW 室温预孵化 30 min。1.2.3LMWH 寸 HUVE 表面 E 选择素表达的影响用 LMWHt 理a（20 ng/ml） 活化的 96 孔板内融合成单层的 HUVEC 5h,每组 3 个复孔，PBS 洗 1 次，分别加选择素单克隆抗体（）20卩 1/孔,37C，孵育 1 h,PBS 冲洗。再加 1 : 50 稀释的 FITC 标记的羊抗鼠 lgG,37C孵育 3