小麦中呕吐毒素的ELISA和HPLC法检测分析

1、小麦中呕吐毒素的ELISA和HPLC法检测分析马晓静摘  要：小麦是粮食作物的一种，小麦的质量直接影响着其销量，且关乎人体健康。小麦中的呕吐毒素含量一旦超标，相关制造业运营的稳定性那么难以保证，导致企业的经济效益不同程度受损。基于此，应用ELISA和HPLC法检测小麦呕吐毒素的含量，既能了解不同检测方法的应用原理，又能全面保证小麦质量。关键词：小麦;呕吐毒素;ELISA法;HPLC法;检测分析文章编号：1005-2690202121-0019-02    中图分类号：R446.6    文献标志

2、码：B我国河北省的小麦产量逐年增多，使用ELISA法和HPLC法准确检测小麦呕吐毒素的含量，将检测结果作为衡量小麦质量、筛选合规小麦的重要标准，以此提升河北省的小麦销量，尽可能降低小麦加工企业的平安风险。从粮食平安保障角度出发，分析ELISA法和HPLC法在小麥呕吐毒素检测中的应用十分必要，能够在一定程度上减轻储粮经济损失。1  呕吐毒素呕吐霉素指主成分为DON的单端孢霉烯族化合物【1】，在禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌作用下生成，因为呕吐霉素中DON结构稳定、毒害性较大，一旦谷物中出现呕吐毒素且含量超过规定标准，那么谷物产品及其加工品的平安风险会大大增加。当前，呕吐毒素常见于小麦

3、、高粱等粮食作物中，经检测可知呕吐毒素的含量，应据此制定可行的管控方法，尽可能减少食品平安问题的发生【2】。2  小麦中呕吐毒素检测的常用方法2.1  ELISA法ELISA法的全称为酶联免疫检测法，这种方法具有操作便捷、快速检测等优点，在小麦呕吐毒素检测中的适用性较强【3】。酶联免疫检测试剂盒作为小麦样品容纳装置，在酶标板孔上预包被呕吐毒素抗原，样本中的呕吐毒素和微孔上预包被抗原竞争呕吐毒素抗体抗试剂，同时呕吐毒素抗体与酶标记二抗酶标物相结合经TMB底物液显色。检测期间，先后参加标准试剂或样本、酶标物、抗试剂，通过孵育结合、洗板等过程，随后添加适量反应

4、物，然后参加显色剂，根据蓝色深度的不同，得知呕吐霉素的含量。一般来说，呕吐毒素含量由低到高，颜色会呈现出由蓝到黄，颜色浅黄代表呕吐霉素含量超标。最后参加终止液令反应停止，直到物质颜色变黄。接下来使用酶标仪检测污染程度，样本的吸光度值与其呕吐毒素含量负相关，与标准曲线比较，再乘以稀释倍数，即可得到呕吐霉素的含量，用以提示工作人员采取相应的管控措施。酶联免疫检测法的缺点是检测环节需要严控温湿度，并且检测结果存在一定误差。2.2  HPLC法HPLC法全称为高效液相色谱法，用这一方法检测小麦中的呕吐毒素含量时，应做好准备工作以减少检测误差，保证检测结果的准确性和全面性【4】。但该

5、检测法具有耗时长、本钱高等缺点，所以检测机构要慎重选用高效液相色谱法。当提出高精度检测要求时，高效液相色谱法更为适宜。3  采用ELISA法或HPLC法检测小麦呕吐毒素3.1  材料及设备呕吐霉素标准液为脱氧雪腐镰刀菌烯醇100 g/mL;呕吐毒素免疫亲和柱由北京华安麦科生产;紫外检测器的型号为Agilent;电子天平的型号为METTLERME;呕吐毒素测试盒的型号为ELISA，产自北京华安麦科;酶标仪型号为680，由BIO-RAD企业生产;高效液相色谱仪来自Agilent企业;粮食测试粉碎磨的型号为JSFM-，来自中储粮成都储藏研究院，旋涡混

6、合器的型号为WH-861，来自上海骥辉企业。3.2  检测方法3.2.1  ELISA法检测小麦中呕吐毒素的步骤ELISA测试盒存放于冰箱低温环境，用其检测小麦呕吐霉素时，由低温环境转移到室温环境，平衡1h以上，反应温度控制在2025。为了直观观察颜色变化，在反应板上妥善放置酶标板微孔，并做好微孔标记工作。接下来，在标准品孔和样品孔中分别参加DON标准溶液和过滤并稀释好的样品提取液，均为50L，逐孔参加50L酶标物、50L抗试剂，轻轻震荡混匀，盖板膜盖好后，置于25避光环境中反应15min，小心揭开盖膜将孔内液体甩干，用洗涤液250L/孔充分洗涤45次，

7、每次间隔10s，在吸水纸上拍干，然后逐孔参加100L底物液，盖板膜盖好后置于25的避光环境中5min，取出逐孔参加50L终止液，轻轻震荡混匀，在BIO-RAD680酶标仪上测量其吸光度450nm/630nm。3.2.2  HPLC法检测小麦中呕吐毒素的步骤色谱柱为C18柱4.6mm×150nm，5m;柱温35，流动速度为0.8mL/min;流动相为甲醇体积比20、水体积比80;检测波长218nm;进样体积为50L。预处理：将小麦样品均匀混合，用电子天平称取25.00g，放置在锥形容器中刻度为250mL，然后分别添加不同规格的标准溶液至0.8g/g、1.2g/g、3

8、.2g/g，之后参加100mL水，均匀混合后震荡20min220r/min，提取适量并离心5min，取上清液，接下来用玻璃纤维滤纸过滤，将免疫亲和柱连接于玻璃注射器，与压力泵连接，分别吸取上述滤液2.0mL，以1滴/s速度流通亲和柱，在空气进入亲和柱之后停止，将流出液去除，并用水5mL对亲和柱进行淋洗2次，流速为2滴/s，在空气进入亲和柱之后停止，同时将流出液去除，滴加甲醇2.0mL，同时以1滴/s流速进行洗脱处理，对所有洗脱液进行收集。在50下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，参加1.0mL流动相溶解残留物，涡旋30s，过滤膜滤进样瓶中。经线性关系分析可知，用20%甲醇-水将呕吐毒素标准贮备液1

9、0g/mL配制工作液，最正确线性关系中呕吐毒素浓度为0.054.00g/mL。3.3  结果及分析3.3.1  ELISA法检测结果取不含呕吐毒素的小麦样品，分别添加水平为0.8g/g和3.2g/g的标准品，降解酶DON含量为0.8g/g时，降解率75.86%;降解酶DON含量为3.2g/g时，降解率约92.57%。降解酶活力受酶浓度、温度两个因素影响，酶浓度45g/mL之前降解率直线提高，酶浓度超过45g/mL后，饱和后降解率趋于平缓。反应温度25时降解率最高。此外，酶活力强弱通过酶作用时长来检验，25时小麦中DON被高效降解，当反应时间延长，DON的

10、降解率再次提高;反应至20min后，降解率平稳变化。当酸碱度变化时，DON降解情况随之改变，反应温度小于25且酸碱值8后酸碱度增加，DON降解幅度减小。3.3.2  HPLC法检测结果为保证检测结果的准确性和真实性，进行精密度、重复性、稳定性、加标回收试验。测定精密度时标准溶液0.4g/mL，进样持续5次，记录峰面积，得知呕吐毒素相对标准偏差为1.35%，精密度良好;測定重复性时，取一式五份平行样品，参照供试品溶液制备方式测试峰面积，得知呕吐毒素相对标准偏差为1.55%，重复性较佳;测定稳定性时取相同样品溶液，在2d内每间隔3h进样分析，并比照峰面积变化情况，呕吐毒素相对标

11、准偏差为0.76%，稳定性良好;测定回收试验时小麦取样量25.00g，对应参加量1.000g/g、测定量0.998g/g、回收率91.704%;小麦另一份取样量同为25.00g时，对应参加量1.000g/g、测定量977.45g/g、回收率92.037%。呕吐毒素相对标准偏差为1.17%。3.3.3  ELISA法与HPLC法比照基于加标回收试验，了解这两种测试方法在小麦呕吐毒素检测中的应用情况，其中，ELISA法程序简单，过滤后能够直接检测，回收率在75%125%之间。相对来讲，HPLC法的检测步骤烦琐，经过免疫亲和柱处理及长时间得到检测结果，回收率在70%90%之间。当

12、加标浓度同时增加，二者差异甚微。间接反映出ELISA测试盒具有实用性，其检测结果可供参考。对于小麦呕吐毒素检测工作者来说，应客观掌握这两种检测方法的应用原理及优缺点，了解二者的异同之处，以便合理选择检测法，快速、准确得出检测数据，确保小麦质控措施的有效制定【5】。例如，针对大量小麦样品快速筛选时，ELISA法更具适用性，因为这一方法易操作、灵敏度高、等待结果的时间短;针对少量小麦样品质量高精度检测时，选择HPLC法更为适宜，其检测结果误差较小，能为后续质控实践指明方向。必要情况下，联合应用ELISA法和HPLC法，既能弥补单一检测方法的缺乏之处，又能得出可靠的检测结果。4  结论综上所述，小麦呕吐毒素测定工作的重要性日益突显，为准确获取小麦中的呕吐毒素含量，视情况选用ELISA法或HPLC法，既能弥补传统检测方法的缺乏，又能真实、准确地测定呕吐毒素浓度，对小麦产品及其加工品的质量优化以及保障粮食平安方面有很好的促进作用。参考文献：1单晓雪，杨娟，廖子龙.二氧化钛光催化对小麦呕吐毒素降解效果的研究J.化学试剂，2021，429：1088-1092.2