第4章植物细胞工程的基本原理和技术基础

1、第四章植物细胞工程的基本原理和技术基础§1. 植物细胞工程的基本原理§2. 植物细胞和组织培养所需要的营养和环境条件§3. 外植体的选择和消毒§4. 外植体的切取和培养§4.1植物细胞工程的基本原理一.植物细胞的全能性二. 植物激素的调控作用4.1.1 植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及

2、发育为完整个体所必需的全部基因。细胞的全能性受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛生芽，最终形成完整的植株。 

3、;       植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件胡萝卜愈伤组织诱导结果胡萝卜愈伤组织诱导结果细胞全能性的绝对性与相对性:(1)不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;(2)即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;(3)动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从

4、强到弱:营养生长中心 > 形成层 > 薄壁细胞 > 厚壁细胞(木质化细胞) > 特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 > 居间分生组织 > 侧生分生组织> 薄壁组织(基本组织) > 厚角组织 > 输导组织 >厚壁组织。脱分化：一个已经停止分裂繁荣成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的细胞团或愈伤组织的现象。再分化：原以分

5、化的细胞经过脱分化后再次分化的现象，最终可进一步形成完整的小植株。离体培养中细胞的脱分化（Dedifferentiation）脱分化外植体愈伤组织或 体细胞胚完整植株脱分化细胞不定器官直接伸长茎尖培养（较大时）完整植株发育幼胚培养（较大时）完整植株愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。愈伤组织的种类：1、胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）：表面光滑、组织结构紧凑、黄绿色、细胞小、易碎、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。易形成芽。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组

6、织结构疏松、细胞大，淡黄色或白色。可以用于悬浮细胞系的建立。4.1.2 植物激素的调控作用生长素：启动细胞的分裂，在细胞的脱分化、形成愈伤组织的过程中必不可少。如IAA、NAA、IBA、2,4-D。细胞分裂素：促进细胞分裂和芽的形成，如KT、6-BA、Zt。4.2 植物细胞和组织培养所需的营养和环境条件一、培养基的组成和配制二、影响植物组织培养的环境条件4.2.1 培养基的组成和配制培养基的基本成分培养基的种类和配制培养基的基本成分 无机成分：大量元素和微量元素碳源：如蔗糖维生素：如肌醇植物生长物质：生长素和细胞分裂素有机附加物一、培养基的成分及其作用（

7、一）无机营养物质培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量元素。大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括N, P, K, Ca,Mg, S。培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供。微量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co、Cl化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。（二）有

8、机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物。1、维生素类物质维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫 胺 素 （VB1 ） 与 愈 伤 组 织 的 产 生 和 生 活 力 有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。2、

9、AA类物质绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly（甘氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Gln（谷氨酰胺）。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖类糖在培养基的作用：1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量3）、维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。4、其它有机物质1）肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成，利于胚和芽的形成。2）天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好

10、的促进作用。（三）植物生长调节物质l植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。l无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。1、生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类： NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-TP（ 2,4,5-三氯苯氧丙

11、酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂；2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；3、形成愈伤组织，促进生根；4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。ABCA：NAA 0mg/L，芽（少），根（无）B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）2、细胞分裂素l是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糖基氨基嘌呤，KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。

12、其中最常用的是6-苄基氨基嘌呤。l功能：1、促进细胞的分裂和分化；2、诱导芽的分化；3、促进侧芽的萌发和生长；4、抑制衰老。ABA：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）控制植物细胞分化l分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件l比例高时产生芽,比例低时产生根3、赤霉素（GA3）生理作用：1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效；2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化；3、破除种子、

13、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发；4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。注：不耐热，应采用过滤灭菌加入4、脱落酸（ABA）生理作用：1、抑制蛋白质的合成；2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用；3、诱导休眠、促进衰老和脱落。以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用ppm表示1ppm=1mg/L培养基的种类和配制培养基的种类：见表4-1 （MS、B5、N6 ）。培养基的配制培养基的配方及培养基的选择一、培养基的种类（根据无机盐的浓度）：1、高无

14、机盐含量培养基钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。2、高硝态氮培养基硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。3、中等无机盐含量培养基大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。4、低无机盐含量培养基大量元

15、素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。二、根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养物的培养基。三、根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。四、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，

16、附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%培养基的筛选：1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养，豆科多用B5培养基。2、植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3、有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。培养基的配制（一）、贮备液（母液）的配制为什么要配制母液？1）、方

17、便2）、准确（有些成分量太小）以MS培养基配制为例：1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。注意：(1) 某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg2十和H2P

18、O4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是 CuSO4·5H2O、 CoCl2·6H2O ，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量10

19、ml，微量ml3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。在 配 制 铁 盐 时 ， 如 果 加 热 搅 拌 时 间 过 短 ， 会 造 成 Fe

20、S04 和Na2EDTA 鳌 合 不 彻 底 ， 此 时 若 将 其 冷 藏 ， FeS04会 结 晶 析出 。 为 避 免 此 现 象 发 生 ， 配 制 铁 盐 母 液 时 ， FeS04 和Na2EDTA

21、应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断 搅 拌 至 溶 液 呈 金 黄 色 ( 约 加 热 20 - 30 min) ， 调 pH 值 至5 .5，室温放置冷却后，保存备用。Heller（1953）别强调铁和氮在植物组织培养中的作用。铁元素为什么单独配制？White培养基中（1943）铁以Fe2(SO4)3；Street和Henshaw(1966) 改

22、用FeCl2取代，也不满意原因一、该方案中含有锰和其他金属离子杂质；原因二、PH值改变导致铁利用下降铁在pH值为5.2左右时对组织是有效的；一周内培养基的pH值4.9-5.0升至5.8-6.0，根开始表现出缺铁的征兆。改进：在培养基中采用Fe·EDTA，在pH值达到7.68.0时铁仍然有效。（Heller，1953）。4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平，并贮存在棕色无菌瓶中 。5、植物生长调节剂母液配制一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：（）

23、配制生长素类，例如IAA、NAA、2，4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。后者效果好。（）细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl溶解，再用蒸馏水定容。（）GA3以95%酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）保存在棕色试剂瓶中。注意：所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠和盐酸来来调整培养基的酸碱度：（ 

24、1 ）1摩尔/升KOH液的配制:称取57.1克KOH,加蒸馏水至1000毫升.（ 2）1摩尔/升NaOH液的配制:称取40克NaOH,加蒸馏水至1000毫升.（ 3）1摩尔/升HCL液的配制:取浓盐酸(比重1.19)、82.5毫升加蒸馏水至1000毫升.配制时先将浓盐酸缓缓加入约800毫升的蒸馏水中,然后用蒸馏水补足至1000毫升.（二）培养基的配制1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度（mg/L）。2、移液取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照

25、计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意：（1）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。（2）量取母液时，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。3、称取琼脂蔗糖备用4、融化用搪瓷量杯量取600700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。5、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，

26、边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右)。7、分装溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1L培养基，可分装2030瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9、培养基的灭菌4.2.2 影响植物组织培养的环境条件温度光照：光照强度、光质、光周期一、光照的影响培养中光照也是重要的

27、条件之一，主要表现在光强、光质、以及光周期等方面：光周期：黑暗与光照交替的时间光量：光照强度光质：光的波长1、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应例1：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的生长，同经光照培养一样的多例2：短日照敏感的葡萄品种，它的茎切段，仅在短日照条件下才能分化成根例3：对日照不敏感的葡萄品种，可在任何光周期下分化成根结论：光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定离体培养中光周期的调节最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照，器官发生阶段：

28、一般给予周期性光照比较好。2、光量的影响光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。离体培养条件下常用的光量，一般为1000-4000lx（勒克斯）。离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照强度的高低直接影响器官分化的频率。高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根。3、光质的影响光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，2周后，分化出愈伤组织

29、。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为419-467nm。对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受600-680nm所刺激。二、温度的影响l培养都是在2327之间进行，一般采用25±2。喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在26-28。冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培养温度控制在18-22 或<25。三、湿度的影响l组织培养中湿度的影响有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求7080%。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。四、pH值不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在