超氧化物歧化酶SOD活性测定ppt课件

1、超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD) (SOD) 活性测定活性测定(NBT(NBT法法) )一、测定意义一、测定意义二、目的要求二、目的要求三、原理三、原理四、仪器设备四、仪器设备五、试剂配制五、试剂配制六、植物资料六、植物资料七、操作步骤七、操作步骤八、结果计算八、结果计算九、本卷须知九、本卷须知十、思索题十、思索题一、意义：一、意义：细胞内自在基的产生和消除处于动态平细胞内自在基的产生和消除处于动态平衡形状，自在基程度很低，不会损伤细衡形状，自在基程度很低，不会损伤细胞。胞。植物正常情况下植物正常情况下植物逆境胁迫下植物逆境胁迫下O-.2O-.2、H2O2H2O2、OHOH的产量添加；的

2、产量添加；SODSOD、CATCAT、PODPOD活性降低；活性降低；VtEVtE、VtCVtC、CARCAR、GSHGSH含量降低；含量降低；从而损伤细胞。从而损伤细胞。植物体内活性氧代谢系统的平衡被突破植物体内活性氧代谢系统的平衡被突破什么叫逆境？什么叫逆境？逆境是指对植物逆境是指对植物生存生长不利的生存生长不利的各种环境要素的各种环境要素的总称总称. . 逆境的种类逆境的种类? ?为什么要测定为什么要测定完全液和缺素完全液和缺素苗的苗的SODSOD活性？活性？二、目的要求：二、目的要求：1.了解SOD活力测定的实际意义；2.掌握SOD测定的原理及操作要点；3.比较完全液溶液和缺素溶液培育

3、的 玉米苗叶片SOD活性的差别。三、原理：三、原理：三、原理：三、原理： 根据根据SODSOD能抑制氮蓝四唑能抑制氮蓝四唑NBTNBT在光下的复原作用来确定酶活在光下的复原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光复原，被复原的核黄素性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-O2.-，可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲，可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲腙，后者在腙，后者在560nm560nm处有最大吸收。而处有最大吸收。而SODSOD可去除可去除O2.-O2.-，从而抑制了甲腙，从而抑制了甲腙的构成。于是光复原反响

4、后，反响液蓝色愈深，阐明酶活性愈低，反的构成。于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，阐明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。四、仪器设备四、仪器设备研钵；玻璃试管研钵；玻璃试管; 40W; 40W荧光灯荧光灯; ; 移液管等。移液管等。五、试剂配制五、试剂配制1、提取介质50mmol/L(pH7.0)磷酸缓冲液。2、反响介质50mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液,内含77.12mol/L硝基四唑蓝,0.1mmol/LEDTA,13.37mmol/L蛋氨酸。3、80.2mol/L核黄素溶液:用含有0.1mmol/LEDTA的50mmol/L

5、(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。SOD反响混合液3.9ml反响介质0.1ml 80.2mol/L核黄素溶液六、植物资料六、植物资料: :玉米叶片玉米叶片: 完全液培育苗完全液培育苗 缺素液培育苗缺素液培育苗七、操作步骤七、操作步骤将玉米叶片剪细将玉米叶片剪细混合均匀混合均匀称称0.2g0.2g( (用保鲜膜包好放低温用保鲜膜包好放低温冰箱预冻冰箱预冻) ) 研磨成匀浆研磨成匀浆再参与再参与3ml3ml缓冲液缓冲液,研磨均匀后研磨均匀后, , 将匀浆液倒入聚乙烯离将匀浆液倒入聚乙烯离心管中心管中低温低温(0(04)4)下、下、4800rpm4800rpm离心离心10min10min上清液即为酶液

6、，上清液即为酶液，将上清液倒入小青霉瓶，低温下储存，供将上清液倒入小青霉瓶，低温下储存，供SODSOD活性测定。活性测定。1、酶液的提取：参与参与2ml2ml冰冷的冰冷的0.05mol/LpH7.00.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液及少量的磷酸缓冲液及少量的石英砂石英砂 研钵研钵 2.SOD 2.SOD活性测定：活性测定： 取取6 6支试管支试管, , 编号编号, , 按下表参与试剂。将按下表参与试剂。将1 1号管用黑纸袋套上号管用黑纸袋套上, , 与其它试管一同放荧光灯下与其它试管一同放荧光灯下, , 光强光强3000Lx3000Lx照光照光10min, 10min, 到时间后关到时间后

7、关灯灯, , 用黑布罩上试管用黑布罩上试管( (如室内光线不强如室内光线不强, , 不罩黑布也可不罩黑布也可), ), 以以1 1号试号试管溶液为参比管溶液为参比, , 测定样品在测定样品在560nm560nm处的吸光度。处的吸光度。 不加酶的不加酶的2 2号试管号试管溶液颜色最深溶液颜色最深; ; 参与酶的由于参与酶的由于SODSOD抑制了硝基四唑蓝的光复原抑制了硝基四唑蓝的光复原, ,颜颜色变浅。色变浅。2、活性测定：取6支枯燥的、玻璃质量一致的普通试管，按下表顺序参与试剂式中：式中：AckAck为为2 2号对看管溶液在号对看管溶液在560nm560nm处的吸光度值处的吸光度值; ; AE

8、 AE为样品测定管溶液在为样品测定管溶液在560nm560nm处的吸光值处的吸光值; ; V V为酶液总体积为酶液总体积ml)ml)； W W为提取酶液的植物资料的鲜重为提取酶液的植物资料的鲜重g)g)； Vt Vt为测定时酶液的用量为测定时酶液的用量(ml)(ml)。 八、结果计算：八、结果计算： Ack-AE)V SOD活性活性(U/g鲜重鲜重) AckWVt50 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的复原抑制到对照一半一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的复原抑制到对照一半(50)时所需的酶量。时所需的酶量。 九、本卷须知九、本卷须知: : 1. 1.所用试管的玻璃质量要一样。所用试管的玻璃质量要一

9、样。包括厚度、直径、质量等。包括厚度、直径、质量等。 2. 2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。背景等。 3. 3.要多做对照消除日光灯管的光质差别。要多做对照消除日光灯管的光质差别。 4. 4. 植物组织中的酚类物质对测定有植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的资料提取酶液时可参与聚乙干扰，对酚类含量高的资料提取酶液时可参与聚乙烯吡咯烷酮消除。烯吡咯烷酮消除。 5. 5.结果计算时要用相邻对看管代入公式计算。结果计算时要用相邻对看管代入公式计算。 十、思索题十、思索题: : 1. 1.在在SODSOD活性测定中为什么设活性测定中为什么设照光和暗中两个对看管。照光和暗中两个对看管。 2. 2.影响本实验准确性的主要要素影响本实验准确性的主要要素是什么？应如何抑制？是什么？应如何抑制？1.1.下次实验：改良半叶法测定植物光合速率下次实验：改良半叶法测定植物光合速率2. 2. 请按请按 B补充资料仔细补充资料仔细书写预习报告！书写预习报告！3. 3. 实验适宜时间：晴天上午实验适宜