生物化学《蛋白质》教案15年教学整理

1、第一章 蛋白质教学基本要求1. 了解蛋白质的生物学意义。2. 掌握蛋白质和氨基酸的组成、分类、结构及主要理化性质。3. 掌握蛋白质结构与功能的关系。第一节 蛋白质概述一、蛋白质的概念蛋白质（protein）是由1条或多条多肽链组成、具有特定空间结构、执行具体生理功能的生物大分子。蛋白质的多肽链是由几十个至数百个氨基酸通过脱水缩合依靠肽键形成，各种氨基酸在蛋白质中按特定的顺序排列使得蛋白质能够形成特定空间结构，形成生命世界中数以万计形形色色的各种功能蛋白质。二、蛋白质的生物学意义 1.是生物体的结构性物质原生质含有蛋白质、核酸、糖类、脂类、水分和无机盐等化学成分，其中蛋白质约占细胞干重的一半或更

2、多，人45%，皮肤63，肌肉80%，细菌52-80%，干酵母4606%。自然界存在一百亿种蛋白质，各种蛋白质都不尽相同，各自担负特殊的生物学功能。2.是生物体的功能性物质蛋白质是生命现象的物质基础，种类多样。造成蛋白质分子如此众多的原因是构成蛋白质分子的Aa种类、数量和排列顺序不同而引起的。 催化作用酶 调节作用激素、一切激素受体和许多其他调节因子 运输作用血红蛋白、膜蛋白 收缩作用肌球蛋白、肌动蛋白、微管蛋白 免疫作用IgG 信息传递味觉蛋白、视紫红质 遗传信息调控组蛋白、阻遏蛋白、调节蛋白 血液凝固血凝的酶和酶原除此之外，蛋白质在高等动物的记忆、识别机构等方面部起着重要的作用。三、蛋白质的

3、化学组成（一）元素组成根据对多种纯品蛋白质的元素分析发现，构成蛋白质的元素主要有C（50-55%）、H（6-8%），O（20-23%）、N（15-18%）、S（0-3%），有些蛋白质还含有微量的P、Fe、Cu、I、Zn、Mo等元素。各种蛋白质N的含量比较接近，平均为16%。因此，一般可通过测定生物样品中含N量来粗略地估算蛋白质的含量，1gN相当于6.25g的蛋白质。（二）单位组成氨基酸（Aa），共20种四、蛋白质的分类蛋白质可根据其分子组成、溶解度、分子形状、组织结构以及功能进行分类。（一）分子组成 简单Pr：核糖核酸酶、胰岛素结合Pr： 核蛋白：核糖体 糖蛋白：膜糖蛋白 脂蛋白：膜脂蛋白 色

4、蛋白：血红蛋白磷蛋白：胃蛋白酶（二）溶解度 可溶性蛋白质 清蛋白：血清清蛋白 球蛋白：血清球蛋白 组蛋白：珠蛋白 精蛋白：鱼精蛋白 醇溶性蛋白：谷醇溶蛋白 可溶性蛋白质：硬蛋白、角蛋白、胶原蛋白等（三）分子形状 球状Pr：血红蛋白、胞质酶类、细胞因子等纤维状Pr ： 可溶性纤维状Pr：纤维蛋白原 不溶性纤维状Pr：角蛋白（四）组织结构 单体蛋白质：仅1个亚基，如核糖核酸酶、溶菌酶 寡聚蛋白质：多个亚基，如血红蛋白、己糖激酶（五）功能 活性蛋白：酶、激素、运输蛋白、运动蛋白、防御蛋白和病毒外壳蛋白 非活性蛋白：胶原、角蛋白、弹性蛋白和丝心蛋白五、蛋白质的大小蛋白质是相对分子质量很大的生物分子，不

5、同蛋白质的相对分子质量变化范围非常大，从约6 000到1×106 ，甚至更大。六、蛋白质的组织层次蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链，但是天然的蛋白质分子并不是一条走向随机的松散多肽链。每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构通常称为蛋白质的构象（conformation）。一级结构（primary structure）指的是多肽链共价主链的氨基酸顺序。二级结构（secondary structure）指的是多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象。三级结构（tertiary structure）是指多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链

6、走向的紧密球状构象。四级结构（quaternary structure）是指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间的相互关系或结合方式。第二节 氨基酸一、氨基酸氨基酸（Amino acid）是蛋白质的基本组成单位。生命界中数以万计的形形色色的各种功能蛋白质，正是由20种基本氨基酸经不同排列组合聚合形成。生物体的氨基酸绝大多数为-氨基酸。由酸水解碱水解酶水解获取。二、氨基酸的结构通式 共同点： NH2和COOH都连在-碳原子上，具两性性质； 除Gly外，其它Aa的-碳原子都为不对称碳原子； 不对称碳原子具旋光性，可使偏振光左转（-）和右旋（+）； 不对称碳原子具立体异构构型，因此，-Aa具有D-型和L-型

7、两种异构体。通常以甘油醛的D-型和L-型来命名。天然的-Aa均为L-Aa。注意构型与旋光方向没有直接的对应关系。三、氨基酸的分类目前从生物界已分离得到各类氨基酸超过250种，根据是否参与组成蛋白质以及在蛋白质中出现的频率，氨基酸可分为蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸；蛋白质氨基酸又分为组成蛋白质的基本氨基酸和修饰型氨基酸。生物体内组成蛋白质的基本氨基酸只有20种，除甘氨酸外皆为L-型-氨基酸。（一）R的极性不同1. 极性Aa（12） 极性不带电荷（7）： 甘（Gly） 丝（Ser） 苏（ Thr） 半胱（Cys） 天冬酰胺（Asn） 谷氨酰胺（Gln）酪氨酸（Tyr）极性带正电荷（3）：赖氨酸（

8、Lys） 精氨酸（Arg） 组氨酸（His）极性带负电荷（2）： 天冬氨酸（Asp） 谷氨酸（Glu）2. 非极性Aa（8） 丙氨酸（Ala） 缬氨酸（Val） 亮氨酸（Leu） 异亮氨酸（Ile） 苯丙氨酸（Phe） 脯氨酸（Pro） 甲硫氨酸（Met ）或蛋氨酸 色（ Trp） （二） R的结构 脂肪族氨基酸（15） 一氨基一羧基氨基酸 一氨基二羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸 芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Trp） 3种芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性pH条件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的1种，常用测量280n

9、m紫外吸收来测定蛋白质的浓度。 杂环氨基酸（His、Pro） （三）氨基酸的酸碱性 酸性氨基酸碱性氨基酸中性氨基酸四、氨基酸的物理性质 1.无色晶体，晶型各异，各味皆有。熔点极高，一般在200以上。2. 大多溶于水，并能溶于强酸强碱，但不能溶解于有机溶剂如乙醇和乙醚。3. 氨基酸由于存在不对称的碳原子，所以具有旋光性。对于只有1个C不对称碳原子的氨基酸存在1对旋光异构体，有2种构型；对于只有n个C不对称碳原子的氨基酸存在2n/2对旋光异构体，有2n种构型。但胱氨酸的构型比较特殊，胱氨酸是由2个半胱氨酸经氧化形成二硫键连接而成，因为它的2个不对称碳原子存在1个对称中心，可以互为镜像，所以只有3种

10、旋光异构体分别为L-胱氨酸、D-胱氨酸和内消旋胱氨酸。象胱氨酸这种由于分子内部2个不对称原子存在对称中心而互相抵消旋光性的物质称为内消旋物。氨基酸旋光性的大小和方向取决于它们侧链基团的性质，并且与测定的条件（溶剂、pH等）有关，因为不同的溶剂或pH会影响-氨基、-羧基及侧链基团的解离状态。在相同的条件下各氨基酸的旋光性是特定的。因此比旋是-氨基酸的特征物理常数之一，是鉴别的依据之一。4. 含苯环的氨基酸在紫外区280 nm具最大光吸收。组成蛋白质的20种基本氨基酸在可见光区都没有光吸收，在近紫外区（200400nm）只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有一定的光吸收。这3种氨基酸的光吸收都在280 n

11、m附近，这是因为它们的侧链基团中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的。利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量测定，这种方法的特点是快速、简便、不消耗样品，但灵敏度较低。五、氨基酸的酸碱性质(一) 氨基酸的两性离子酸、正、阴 两性、不动 碱、负、阳pHpI pHpI pHpI两性离子或兼性离子是指同一个分子上既带有正电荷又带有负电荷，可进行两性解离的分子。(二) 氨基酸的酸碱滴定根据Handerson-Hasselbalch公式：质子受体 质子供体pH=pKa + lg利用所给氨基酸分子的pKa1和pKa2及pH数据，即可判断出该分子占优势的离子形式，且能计算出在

12、任何pH下某种氨基酸的各种离子的比例。(三) 氨基酸的等电点1. 概念（pI）2. 求法 所以，同理， 一氨基一羧基Aa，pI=pK1(-COOH)+pK2(-NH2)/2一氨基二羧基Aa，pI=pK1(-COOH)+pK2(R- COOH)/2二氨基一羧基Aa，pI=pK2(-NH2)+pK3(R-NH2)/2 结论：等于两性离子两侧的pK值之和之半。一般一氨基一羧基Aa 的pI都在pH6.0左右；一氨基二羧基Aa的pI较小，小于4；二氨基一羧基Aa 的pI较大，大于7。3. 特性 溶解度最小，易沉淀(四) 氨基酸的甲醛滴定虽然氨基酸在溶液中以两性离子形式存在，既可是酸也可是碱，但氨基酸却不

13、可直接用酸、碱滴定进行定量测定。这是因为滴定时终点的pH值过高（11-13）或过低（1-2），无适当的指示剂指示。当加入过量的甲醛时，由于甲醛可与氨基酸的-NH2反应（反应式见-氨基参与的化学反应）降低氨基的碱性，相对增加-N+H3酸性解离，使pKa由9.6降至7附近，氢氧化钠滴定的终点下移至pH9附近，落在酚酞指示剂变色范围内，所以可以进行滴定定量测定。甲醛滴定法（formol titration）是测定氨基酸的一种常用方法，也可用来测定样品中的氨基氮。六、氨基酸的重要化学反应由于存在游离的-氨基和-羧基以及侧链含有羟基、酚基、巯基、咪唑基、胍基、吲哚基、甲硫基等功能基团，氨基酸可以参与多种

14、化学反应，下面从四个方面分别介绍一些在蛋白质化学的研究和应用中具有重要意义的化学反应。（一）-氨基参加1.HNO2反应氨基酸的-氨基定量地与亚硝酸作用产生羟酸和N2，所生成的N2可用气体分析仪加以测定，这是Van Slyke氏法测定的氨基氮的基础，也可用于氨基酸的定量和蛋白质水解程度判定。亚硝酸与氨基酸氨基的反应如下：-氨基(如赖氨酸)与HNO2作用较慢，-氨基在室温下3-4分钟作用即完全。脯氨酸、羟脯氨酸环中的亚氨基，精氨酸、组氨酸和色氨酸环中的结合N皆不与HNO2作用。2.HCHO反应甲醛滴定法甲醛滴定法可用来测定蛋白质的水解程度。3. 酰化试剂反应氨基酸的-氨基在碱性溶液中可与酰化试剂酰

15、氯反应生成酰胺，反应式通式为：苄氧甲酰氯(Cbz-Cl)、叔丁氧甲酰氯(Boc-Cl)、对甲苯磺酰氯(Tos-Cl)、丹磺酰氯（DNS-Cl）与氨基酸反应生成酰胺后，封闭了-氨基，使-氨基不再参与其他反应，因此这些试剂在多肽和蛋白质合成中常用为氨基的保护剂。苄氧甲酰氯反应丹磺酰氯反应丹磺酰氯是5-二甲氨基萘-1-磺酰氯的简称。与氨基酸反应，生成DNS-氨基酸。DNS-氨基酸在酸性条件下非常稳定，6mol/L HCl 100也不破坏；且有强烈荧光，检测灵敏度高，所以被用于蛋白质和多肽N末端氨基酸的分析及微量氨基酸的定量测定。反应如下：氨基酸的-氨基也可与酸酐类酰化试剂如邻苯二甲酸酐在碱性溶液中反

16、应生成酰胺，同酰氯一样该类试剂在多肽和蛋白质合成中也可用为氨基的保护剂。 4.烃基化反应氨基酸的-氨基的氢原子可以被烃基（包括环烃）及其衍生物取代生成烃基化氨基酸。DNFB 反应在弱碱性溶液中，氨基酸-氨基很容易与DNFB作用，生成稳定的黄色2,4-二硝基苯氨基酸(简称DNP-氨基酸)。多肽或蛋白质N端氨基酸的-氨基也能与DNFB反应，生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。当DNP-多肽或DNP-蛋白质用酸水解时，所有的肽键被切开，只有DNP基仍连在N端氨基酸上，形成黄色的DNP-氨基酸。利用DNP氨基酸在有机溶剂中的溶解度与其它氨基酸不同，可以用乙醚把DNP-氨基酸抽提出来，从而与其它氨基酸分开

17、。所得DNP氨基酸经纸层析，从纸层析图谱上黄色斑点的位置可鉴定N端氨基酸的种类和数目。这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，英国的Sanger首先利用该反应来测定胰岛素的氨基酸序序列，所以DNFB称为Sanger试剂。现在常应用于多肽和蛋白质N-末端测定。PITC反应在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基还可以与异硫氰酸苯酯(PITC)反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)，在无水酸中，PTC-氨基酸即环化变为苯硫乙内酰脲(PTH-AA)。后者非常稳定，可用层析法等方法加以分离鉴定。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸，因此也称Edman反应， PITC称为Edm

18、an试剂。在多肽和蛋白质的氨基酸顺序分析方面Edman反应占有重要地位。蛋白质多肽链N端氨基酸的-氨基也可与PITC起上述反应生成PTC-蛋白质，在酸性溶液中，它就释放出末端的PTH氨基酸和比原来少了一个氨基酸残基的多肽链。所得的PTH-氨基酸经乙酸乙酯抽提后，用层析法进行鉴定，确定肽链的N端氨基酸种类。剩余的肽链可以重复应用这方法测定其N端的第二个氨基酸。如此重复多次就测定出多肽链N端的氨基酸排列顺序。目前根据此原理，设计出“多肽顺序自动分析仪”进行自动测定，用这种仪器，一次可连续测出60个以上的氨基酸顺序。5.转氨基、脱氨基反应在生物体内经转氨酶的催化，氨基酸可将-氨基转移给一些酮酸，生成

19、新的相应的酮酸和氨基酸的过程称为生物转氨基作用。在转氨基过程中，氨基酸的-氨基能与醛类物质反应生成西佛碱（Schiffs base），西佛碱是以氨基酸作为底物的某些酶促反应的共同中间物。氨基酸在生物体内经氨基酸氧化酶的催化下还可脱去-氨基转变为酮酸。（二）-羧基参加氨基酸的-羧基和其他有机酸的羧基一样，可以发生成盐、成酯、成酰氯以及发生叠氮和脱羧反应等。 成酯和成盐反应 此反应常用于多肽合成中的羧基保护，当羧基变成酯后，羧基的化学性质就被掩盖，而氨基的化学性质就突出地显示出来。成酰氯反应将氨基保护（Y表示保护基团）以后，氨基酸可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯。该反应使氨基酸的羧基活化，易于另

20、一氨基酸的氨基结合，在多肽人工合成中用于活化羧基。 成酰胺在体外，氨基酸酯与氨(在醇溶液中或无水状态)作用即可形成氨基酸酰胺。脱羧反应在生物体内氨基酸经氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase）的作用，可脱去羧基，形成伯胺。叠氮反应将氨基酰化保护、羧基甲酯化以后，氨基酸与肼和亚硝酸反应能够生成氨基酸叠氮化合物。该反应可以活化羧基，常用于多肽人工合成。（三）共同参加1.茚三酮（ninhydrin）反应-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的-酮酸，酮酸进一步氧化变成醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、氨和另一分子水合茚三酮反应，缩

21、合成蓝紫色的物质。脯氨酸和羟脯氢酸与茚三酮反应产生黄色物质，其余所有的-氨基酸与茚三酮反应均产生蓝紫色的物质。氨基酸与茚三酮反应非常灵敏，几微克与茚三酮反应就能显色。根据蓝紫色的深浅，在570 nm波长(黄色440 nm) 下测定光吸收值，再与标样的光吸收值进行比较，就可测定样品中氨基酸的含量。采用纸层析、离子交换层析和电泳等技术分离氨基酸时，常用茚三酮溶液作显色剂，以定性和定量测定氨基酸。其反应过程如下。2.成肽反应一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。（四）R参加氨基酸侧链带有多种功能基团（羟基、酚基、巯基、咪唑基、胍基、吲哚基、甲硫基以及非-氨基、非-羧基等）

22、，每种功能基团又可以和多种化学试剂起反应，因此氨基酸侧链可参与的反应是非常多的，其中有些反应在一定条件下是特异性的。对于氨基酸侧链特异性的和显色的反应，现在常用于蛋白质的化学修饰和氨基酸鉴别检验及定量测定。所谓蛋白质的化学修饰就是在较温和的条件下让蛋白质与某种试剂起特异性反应，使蛋白质中某类氨基酸侧链的功能基团发生变化；同时观察蛋白质的结构以及功能的变化情况，以判别氨基酸残基在蛋白质的结构和功能中的重要性。1.Pauly反应-Tyr、His酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物（例如对氨基苯磺酸重氮盐）反应生成显色物质，可用于定性、定量测定。酪氨酸生成的为桔黄色化合物，组氨酸生成的为棕红色化合物。2.坂

23、口反应-Arg精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色的化合物。此反应用于胍基的鉴定。3.米伦反应-Tyr酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，这是鉴定酚基的特性反应。4.乙醛酸反应-Trp色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环。此反应用于鉴定吲哚基。5. Folin-酚试剂反应-Tyr、Phe蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基可还原Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐，生成深蓝色物质（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质含量的测定。Folin酚试剂法（又称Lowry法）是蛋白质测定方法中最灵

24、敏和应用最广泛的方法之一。6.精氨酸的侧链反应-Arg精氨酸侧链的胍基在硼酸钠缓冲液中可与1，2-环己二酮或丁二酮生成稳定的环类缩合物。在存在一定浓度的羟胺时，此缩合物可发生逆转，重新生成精氨酸。此反应常用于蛋白质的化学修饰研究。7.半胱氨酸巯基及胱氨酸二硫键反应-Cys卤代烷类反应半胱氨酸的-SH是很活泼的，反应性很高。在微碱性条件下，可解离成硫醇阴离子（-CH2-S-），很容易与卤代烷类化合物（碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等）反应生成稳定的烷基衍生物。+ ICH2COO-+ I-O2氧化还原反应半胱氨酸的-SH很容易被空气中的氧或其他氧化剂氧化形成胱氨酸（含二硫键-S-S-），痕量的金属离子（

25、Cu2+、Fe2+、Mn2+等）具有催化作用。为防止氧化形成二硫键，一般可用上述卤代化物对肽链上的-SH进行保护。 + H2O 胱氨酸强氧化剂（例如过甲酸）作用下，-SH和-S-S-均可被氧化形成磺酸基（-SO3H）。-S-S-还可以重新被还原成-SH，一些含巯基的还原剂（简称R-SH），如巯基乙醇、 巯基乙酸和 二硫苏糖醇可以还原-S-S-生成半胱氨酸，而其本身被氧化成二硫化合物。-SH和-S-S-氧化还原关系如下：胱氨酸的二硫键在稳定蛋白质的空间结构方面起很大的作用，但在蛋白质的序列测定时却需要拆开二硫键，在这里我们既可以用氧化的方式，也可以用还原的方式拆开他们，各有利弊。氮丙啶反应H2C

26、 NHH2C H-OOC - C- CH2-SH + N+H3胱氨酸的巯基可打开乙撑亚胺（ethyleneimine）又称氮丙啶（aziridine）的环生成-氨乙基半胱氨酸（AECys）： H-OOC - C- CH2-S-CH2-CH2- N+H3 N+H3 AECys的位有氨基，结构类似赖氨酸，这使本来作用于赖氨酸的胰蛋白酶也能在该位点进行水解。在氨基酸序列测定时此反应也可用于保护肽链上的-SH，防止重新氧化形成二硫键。Ellman试剂反应半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，DTNB）或称Ellman试剂反应，生成硫硝基苯甲酸。硫硝基苯甲酸在pH8

27、.0时在412nm有最大光吸收。此反应可用于分光光度法测定-SH的量，在蛋白质的化学修饰研究中具有一定的作用。重金属络合反应半胱氨酸巯基能和多种重金属离子（如对氯汞苯甲酸）形成络合物。这是蛋白质结晶学中引入重原子的最常用方法之一。更需要掌握的是由于很多蛋白质和酶的活性中心涉及巯基，一旦巯基与重金属离子络合成硫醇盐时将导致其失去活性，因此在蛋白质和酶的分离纯化过程中尤其注意避免混入重金属离子。七、氨基酸混合物的分析分离氨基酸混合物的分析分离主要采用分配层析，包括纸层析、薄层层析、柱层析、气液层析和高效液相层析等。所有的层析系统通常都由两个相组成，其中一个相是固定不动的，称为固定相；另一相是移动的

28、，称为流动相。当两相作相对流动时，混合物中各组分因物理或化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）在两相中的分配程度不同，可以达到分离的目的。1.纸层析纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂（展层剂）是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约23cm的某一处，该点称为原点。然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用相对迁移率（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf是指在纸层析

29、中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值（图3-15）： 在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。对于Rf值差异较小的物质，在进行一个方向展层后；将滤纸烘干、旋转90°；再换用另一展层剂进行展层，可以得到较好的分离效果。这便是双向纸层析（two-dimensional paper chromatography）。 2.薄层层析薄层层析是将吸附剂（硅胶、纤维素粉、氧化铝粉等）均匀涂铺在平面板（如玻璃板、塑料片、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25 mm左右）,并以此薄层进行层析分离的方法。此法具有吸附容量大、分辨率高、层析速度

30、快等特点，是目前最被广泛应用的层析方法之一。操作上与纸层析一样将样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜展层剂进行展层。 3.离子交换柱层析离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography）是将离子交换树脂装入玻璃柱为固定相，以洗脱液（含有与离子交换树脂有离子交换能力的缓冲液）为流动相而进行分离的一种层析方法。离子交换树脂是一种人工合成的、带有酸性或碱性可交换基团的、水不溶性并具有网状结构的高分子聚合物（如聚苯乙烯-苯二乙烯等）。依据离子交换基团的类型，可将将离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。酸性：碱性：与离子交换剂结合的Aa经适

31、当电解质溶液洗脱, Aa离子又会重新交换出来，如果将Aa溶液徐徐通过装有离子交换剂的玻璃管进行离子交换后，再行洗脱，则因各种Aa与离子交换剂的亲和力不同，被洗脱下来的Aa顺序必然不同，亲和力小的Aa先被洗脱下来，这样，就可使溶液中的各种Aa彼此分开。分离氨基酸混合物一般用强酸型阳离子交换树脂。在pH23时，氨基酸主要以阳离子形式存在，可与树脂上阳离子交换而吸附在树脂上。氨基酸的吸附能力主要取决于自身的带电状况，同时也受到其侧链基团与树脂基质之间疏水作用的影响。当逐步提高洗脱液的pH或增加洗脱液中盐的浓度时，氨基酸由于自身带电状况发生变化（例如由带正电荷变为带负电荷、带2个正电荷变为带1个正电荷

32、等）而逐渐解离下来，或被更高浓度的阳离子分步交换下来。目前已有全自动化的氨基酸分析仪（amino acid analyzer），氨基酸的全部洗出顺序。第三节 蛋白质的结构一、蛋白质的一级结构(初级结构)（一）概念指多肽链中依靠肽键共价连接的氨基酸残基的排列顺序。1. 多肽的概念 二肽：三肽、四肽、五肽： 肽 寡肽：多肽（链）：20环肽 肽键：氨基酸残基：多肽链中各个Aa 单位叫。平均分子量为120。 肽平面：Aa分子缩合成肽，其中C-CO-NH-C这六个原子所共有的平面。 N端： C端：2.多肽的命名 原则： 从N端开始命名为“某氨酰某氨酰某某氨基酸”。 3.多肽的理化性质 肽键中的酰胺氢在p

33、H0-14范围内不解离。对于较短的多肽，其酸碱性质主要取决于肽键中游离的末端-NH2与-COOH以及侧链R基上的可解离基团；对于长链多肽或蛋白质而言，其酸碱性质主要取决定于侧链上的可解离基团。在同一pH范围内可以有多个侧链解离。所以多肽的滴定曲线比较复杂，很难用单个侧链基团的解离来分析。多肽等电点。多肽中游离的-NH2、-COOH和侧链R基也可以发生与氨基酸中相应基团相类似的反应。双缩脲反应。它是多肽和蛋白质所特有的一个颜色反应，氨基酸不发生该反应。双缩脲反应是CuSO4碱性溶液可与含有两个或两个以上肽键的化合物生成紫红色或蓝紫色的复合物的反应，利用这个反应可以测定蛋白质的含量。（二）共价键

34、肽键 二硫键 链内环 链间桥 （三）举例胰岛素是第一个被阐明化学结构的蛋白质，1953年Sanger等人测定。由51个Aa组成，相对分子质量5734，由两条肽链组成，一条称A链，一条称B链。A链 21Aa 链内A6-A11B链 30Aa 链间A7-B7；A20-B19（四）测定1. 一级结构测定的一般策略（1）首先要确定蛋白质分子中多肽链的数目根据蛋白质N-末端或C-末端氨基酸残基的摩尔数和蛋白质的摩尔数，可以确定蛋白质分子中的多肽链数目。（2）对于寡聚蛋白质，要拆分蛋白质分子的多肽链对于寡聚蛋白质，如果是多肽链（亚基）间是借助非共价相互作用缔合的，可用变性剂如8 mol/L尿素、6 mol/

35、L盐酸胍或高浓度盐处理，使各亚基拆开；是通过共价二硫键（-S-S-）交联的，则可采用氧化剂或还原剂将二硫键断裂。（3）断开多肽链内的二硫桥对于同一多肽，如果链内存在半胱氨酸残基，并且在它们之间形成了二硫键（-S-S-），则必须在进行第4步分析前，采用氧化剂或还原剂断裂二硫键。（4）分析每一条多肽链的氨基酸组成取经分离纯化的多肽链部分样品，进行完全水解，测定它的氨基酸组成（amino acid composition），并计算出各种氨基酸残基的数目。（5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端的氨基酸残基。取经分离纯化的多肽链的另一部分样品，进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。（6）

36、将各多肽链裂解成较小的肽段用2种或多种不同的裂解方法，将每条多肽链样品降解成2套或多套相互重叠的肽段。对每套肽段进行分离、纯化，并进行氨基酸组成和末端氨基酸残基分析。（7）对各肽段的氨基酸序列进行测定最常用的肽段测序方法为Edman降解法。目前，根据Edman降解法的原理，设计了商品化的自动序列分析仪，已用于测定。此外，还有酶解法和质谱法等。（8）重构完整的多肽链一级结构利用2套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠，就可以重构出原来的完整多肽链的氨基酸序列。（9）确定多肽链间或链内二硫键（S-S）的位置一般采用对角线电泳技术，确定多肽链间或链内二硫键的位置。此外，测序时对被测蛋白质样品的要求

37、也较严格，样品必须均一，纯度在97%以上，同时必须知道其相对分子质量。2. N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 氨肽酶N端 DNFB DNS-Cl PITC 羧肽酶 C端 肼解法肼 还原法硼氢化锂 3. 二硫键的拆分由于蛋白质或多肽链中的二硫键可能处在分子内部，一般需要先有8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍使其变性为松散而成无规则的构象，暴露出分子内部的二硫键，这样才有利于拆分。由于多肽链中半胱氨酸残基的-SH不稳定，当用巯基化合物打开二硫键时，还需烷基化试剂（如碘乙酸）保护-SH，以防止其重新被氧化。 过甲酸氧化法：HCOOOH 巯基化合物还原法：巯基乙醇4. 氨基酸组成的分析用酸水解

38、为主、碱水解为辅，将待测多肽样品完全水解，再用氨基酸分析仪对其氨基酸组成进行分析。酸水解一般使用6 mol/L HCl，所得氨基酸不消旋，但Trp会遭破坏，Ser、Thr和Tyr也遭到部分破坏，同时Asn和Gln的酰胺基会被水解，但酰胺基总量可由水解液中的氨量求出。近年来，有使用甲基磺酸代替盐酸进行酸水解的趋势。碱水解通常用5 mol/L NaOH，水解液中虽然很多种氨基酸遭受破坏，但Trp能定量回收。5.多肽链的裂解和肽段的分离纯化（1）多肽链的裂解鉴于目前多肽序列分析方法一次只能准确测定几十个氨基酸残基，而天然蛋白质分子的氨基酸残基远大于这个数量，因此必须将多肽裂解成较小的肽段，然后将其分

39、离出来再测定每一小肽段的氨基酸序列。裂解多肽链的方法有酶裂解法和化学裂解法，下面分别简述： 胰蛋白酶：Lys或Arg残基的羧基形成的肽键，但Lys或Arg残基羧基端连接Pro时无法水解 胰凝乳蛋白酶：Phe、Trp和Tyr等芳香族氨基酸或其他疏水性氨基酸残基的羧基端肽键 酶裂解法 嗜热菌蛋白酶：水解疏水性残基（如Leu、Ile、Phe、Val等）的氨基端肽键 胃蛋白酶：水解疏水氨基酸残基之间的肽键。 其他蛋白酶：如木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶。木瓜蛋白酶能水解Arg 和 Lys 残基的羧基端肽键敏感；葡萄球菌蛋白酶在磷酸缓冲液（pH 7.8）中，它断裂Glu残基和Asp残基的羧基端肽

40、键，在碳酸氢铵缓冲液（pH 7.8）或醋酸铵缓冲液（pH 4.0）中，则只能断裂Glu残基羧基端肽键，是近年来应用最广泛的一种蛋白酶；梭菌蛋白酶裂解Arg残基的羧基端肽键。 溴化氰断裂法：溴化氰（CNBr）的断裂位点是甲硫氨酸残基的羧基端肽键。化学裂解法 羟胺断裂法：羟胺能断裂Asn-Gly之间的肽键，但Asn-Leu与Asn-Ala之间的肽键也能部分裂解，其专一性不很强（2）肽段的分离纯化多肽链用上述方法断裂后，通常使用凝胶过滤、凝胶电泳和高效液相色谱等方法对肽段混合物进行分离纯化。6.肽段氨基酸序列的测定（1）Edman化学降解法：又称为PITC法，是Edman于1950年首先提出的。利用

41、Edman降解法测定氨基酸顺序，其工作量大、操作程序非常麻烦，一次只能连续测出60 -70个氨基酸残基的序列。基于Edman降解法原理的蛋白质序列分析仪的出现，既免除了手工测定的麻烦又提高了分析的灵敏度，蛋白质样品的最低用量在5 pmol水平即可。 （2）串联MS法串联MS法（质谱法）也已用于氨基酸序列测定。将一种称为电喷射电离（electrospray ionization，ESI）技术与质谱法进行串联（ESI tandem MS），可用于蛋白质测序。该方法灵敏度高，所需的样品量极少（<10-12 mol水平），测定速度快，经毛细管HPLC分离后的多肽混合物可直接进样串联质谱仪，能免去

42、繁重的多肽分离纯化工作。目前，串联MS仅限于小肽段的测序，一般不超过15个氨基酸残基。除串联质谱法外，GS-MS联用法也用于氨基酸序列分析，并有不少成功的报道。（3）酶降解法（氨肽酶、羧肽酶）此外，还可以根据核苷酸序列推定氨基酸序列。由于核酸分子中的三联体密码子决定了蛋白质分子的氨基酸序列，因此可用待测的蛋白质的抗体沉淀合成此种蛋白质的多核糖体，分离出其mRNA，再反转录成cDNA（互补DNA，complementary DNA)，测出cDNA的核苷酸序列后便可推测出蛋白质的氨基酸序列。7.肽段在多肽链中的次序 为了能正确排列用各小肽段在多肽链中的次序，利用2套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错

43、重叠，就可以重构出原来的完整多肽链的氨基酸序列。8.二硫键位置的确定一般采用先胃蛋白酶水解二硫键未被拆开的蛋白质。选用胃蛋白酶至少有2个原因，一是由于该酶专一性不强，水解位点较多，生成的肽段包括含有二硫键的肽段都比较小，易于进一步分离与鉴定；二是该酶的最适pH值为2，而在该条件下二硫键是稳定的，不易发生交换反应。然后将所得肽段混合物用Brown及Hartlay的对角线电泳（diagonal electrophoresis）进行分离。先把水解后的肽段混合物点到滤纸的中心，在pH 6.5的条件下，进行第一向电泳，然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S断裂，使每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨

44、酸的肽段。滤纸旋转900角，在与第一向电泳完全相同的条件下进行第二向电泳。不含二硫键的肽段的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角线上；而每个原来含二硫键的肽段变成了2个含磺基丙氨酸的肽段，后者分子量变小而且负电荷增加，结果它们都偏离了对角线（图3-29），茚三酮显色即可确定其位置。将每对含磺基丙氨酸的肽段分别取下，测定其氨基酸序列并与多肽链的氨基酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链间和/或肽链内的位置。 对角线电泳图解（a、b两个斑点是又二硫键断裂后产生的肽段）（五）多肽的人工合成1.概念多肽的人工合成就是将不同的氨基酸按照一定顺序经接肽反应控制合成多肽链的过程。2.过程（1）接肽保护保护氨基酸的N-末端的-NH2、C末端的-COOH和侧链上的活泼基团，既能在接肽反应时起保护作用，又能在接肽完成后很容易除去，不致引起肽键的断裂。