血管平滑肌细胞增生抑制药试验

1、血管平滑肌细胞增生抑制药试验 血管普通可分为内膜、中膜和外膜三层，平滑肌细胞是中膜的主要细胞成分。在as和血管重建术后再梗死的主要病理基础中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,vsmc)的移行和过度增殖起着极其重要的作用。每当血管内皮细胞受损时，单核细胞和血小板黏附并分泌细胞生长因子，可刺激vsmc移行与增生，已知不少物质具有这类作用。无数学者认为vsmc是as发病学的主要实质细胞，在阐明as的病因及发病机制中有很重要的地位。抑制vsmc移行和增生的物质，可抑制as病变形成和血管成形术后再梗死。vsmc体外培养办法的建立，有助于了解其分化、生长及其在血管性

2、疾病中的作用及药物对vsmc的挺直影响。 取动物或人血管的中膜举行分别，在合适的环境下能使vsmc举行生长和传代。常用家兔、大鼠、牛、猪、羊及流产胎儿主动脉、肺动脉及脑动脉。培养办法按照试验要求选取。在相同条件下观看细胞生长密度，dna合成，可观看药物对vsmc生长的影响。 【材料】 1兔、大鼠、猪、牛、猴、人胚、胎儿和成人的血管，均可用于平滑肌细胞培养。取材部位以胸主动脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管和肠系膜血管最常用。其中以兔主动脉最常用。 2、培养基、结晶紫、m1t,3h-tdr药盒。 3仪器与试剂净化工作台、c02孵箱、倒置显微镜、液体闪耀计数仪、分光光度计、多孔扫描分光光度计。

3、【办法】 1贴壁组织块培养在无菌操作条件下取出所需血管，以hanks液洗去血污，在盛有hanks液培养皿中剥离外膜，纵行剪开血管，使内膜朝上平摊于平皿中，以圆钝的镊子或剪刀背轻轻刮去内皮细胞，将剥去外、内膜的动脉中层用培养液洗净。剪去两端夹钳过的组织，以锐利的虹膜剪剪成约1 mm3小块。用弯头种植针或尖嘴镊，将组织块以互相间隔0.5mm左右距离规章罗列于培养瓶中或培养皿中，倒置培养瓶或皿，加入含1020的培养液，在37 c02孵箱中静置57小时后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸泡在培养液中，放回孵箱继续培养，每3天换液一次，普通47天细胞从组织块边缘长出。23周浮现致密的细胞层，这时取出组织块，使

4、细胞生长至融合。 2簇拥细胞原代培养法又称酶解离法无菌条件下，将新奇的动脉快速置于含hanks液的平皿中，认真清洗并剥去血管表面的纤维、脂肪和多余的血块。将血管移入另一含酶消化液（无ca2+-mg2+ hanks液配制的含有1g/l，0.5g/l弹性酶）的平皿中，37消化0.51.5小时后，用眼科镊认真剥去外膜及外层中膜，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注重不要混入内皮细胞，将组织块切成12mm2，移入另一新奇含酶消化液的平皿中，37消化23小时并时常振荡，收集细胞悬液并用同法再消化一次剩余的组织块，合并细胞悬液与5倍量含10的培养液混匀于离心管中，1500r/min离心5分钟，收集细胞并重新

5、悬浮于培养液中调节细胞数，然后转入培养瓶或培养皿中培养，接种密度为（14)x105/cm2。普通2小时后细胞开头逐渐贴壁，68小时所有贴壁，每23天换培养液一次，12周细胞生长融合成单层细胞时，即可传代培养。 3微血管平滑肌细胞培养（culture of microvascular smooth muscle cells）大血管和微血管平滑肌细胞的分化及功能较大差别，因此微血管平滑肌细胞的培养近年米亦成为一项重要技术，尤其是在脑血管疾病的讨论中。下面以脑血管为例，介绍其微血管平滑肌细胞培养。 无菌条件下，取出大脑半球，置于含有25mmol/l hepes的hanks (ph 7.4)液中，剪碎

6、脑组织并匀浆，匀浆液用孔径为210um的尼龙网举行过滤后，将滤网浸于上述液体中且不断摇摆，以使网上含有大量微血管的组织块脱落于液体中，800r/min离心5分钟，将离心所得组织块溶于消化酶(0.125g/l弹性酶,1g/l胶原酶，0.375g/l大豆胰酶抑制剂，0.2mmol/l，15mmo1/l hepes,2g/l，用dmem配制）中，37水浴振荡培养60分钟，用吸管吹打组织悬液，800r/min离心5分钟，收集细胞团块并悬浮于培养基中，分装至培养瓶中，置于37 5% c02培养1218小时，认真吸去未贴壁细胞和细胞团块，更换新奇培养液。当细胞形成致密层时，即可传代培养。 当原代细胞生长成

7、片时，即可传代。传代时，倾去培养液，以hanks液洗涤培养瓶或皿2次，然后以0.25%-0.02% edta（）混合液笼罩细胞表面，在室温下作用约2分钟，在倒置显微镜下见到大部分细胞收缩、边缘清晰（约80细胞成为游离细胞）时即翻转培养瓶停止消化，倾去消化液，加入含10小牛血清培养液，用吸管轻轻反复轻轻吹打瓶壁，把细胞吹打成悬浮状，800r/min离心5分钟，细胞用新奇培养液混匀，举行细胞计数。以5x1045x105/ml密度接种在新培养瓶中，在37,5% co2孵箱中培养，每3天换液一次，至细胞生长至致密单层时（710天），可依法举行其次次传代。 4试验设计普通传至56代，得到数量较大而又均一

8、细胞，举行试验。试验常在96孔或24孔培养板中举行。给药组加入不同浓度药物，预孵一定时光，与对比组比较，观看药物对生长刺激因子的作用。 【结果与分析】 1细胞鉴定 (1)形态观看：在倒置相差显微镜下，原代和5代以内的平滑肌细胞常呈针形，5代以上的平滑肌细胞其外形增大。当细胞长满瓶底时，典型的平滑肌细胞为梭形或长梭形，平行呈束状罗列，亦可重叠生长达多层，密集与稀疏交错呈“峰”与“谷”状。峰处细胞密集、多层，谷处细胞稀疏，有13层细胞甚至没有细胞。这一特点易与成纤维细胞区分，后者可表现为“同心圆”状的生长形式。 (2）免疫荧光检查：大多数状况下，仅靠光镜区分平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞是很困难

9、的。利用免疫荧光技术，鉴别分化型平滑肌细胞特有的标志蛋白肌宁蛋白和a一肌动蛋白是一种十分实用的鉴别办法。 (3）透射电镜观看，可把平滑肌细胞分“合成型”与“收缩型”二型。平滑肌细胞原代培养的最初一周以“收缩型”为主，以后逐渐向“合成型”转化而大量增殖。合成型胞质弥漫粗面内质网，囊腔扩大，弥漫蛋白质，核中异染色质较多，但粗或细肌丝很少，肌动蛋白的抗体荧光染色阴性，细胞无收缩功能。“收缩型”细胞是平滑肌细胞的典型表现，主要特征为胞质内有成束状罗列的束状肌丝，与细胞长轴平行，肌束之间可见与其相连的致密体。细胞膜附近可见特有的密斑和吞饮小泡，细胞有收缩功能。传代培养细胞最初从“收缩型”转化为“合成型”

10、很快，约610天又恢复，但已无收缩功能。 2结晶紫染色法将细胞以一定密度接种在24孔培养板，举行试验试剂处理，试验终止时吸出各孔培养液，以1（溶于hanks液）1 ml/孔固定15分钟，吸出上清液。以0.1结晶紫（溶于三重蒸馏水中）1 ml/孔染色30分钟，吸出上清液，以去离子水轻轻洗涤15分钟，吸去上清液，将培养孔在自然条件下晾干，即可在倒置显微镜下举行形态观看及照相。然后每孔加入0.2% triton x-100溶液1 ml，使细胞内结晶紫溶解，于 595 nm波特长比色举行吸光值测定，以作定量分析。 3. mtt比色法mtt3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5

11、-diphenyl tetrazolium bromide,溴化四氮唑盐能进入活的线粒体内与各种脱氢酶反应，所以是测定细胞成活及增生的办法。以pbs溶解mtt制成5 mg/ml溶液，抽滤灭菌。按每孔100ul培养液加入10ul的量，把mtt加入细胞培养孔内，在37继续培养4小时。取出培养板，吸出孔中培养液，每孔加入100ul酸性异(0.04ml/l hcl)，使深蓝色（甲攒）结晶彻底溶解。在室温下放置数分钟，确认结晶彻低溶解后即把培养板在波长570nm,630nm，校准设在1.99（如样品着色过强，则设在1.00）的多孔扫描分光下读数。在加入异丙醇后1小时内测定完毕。也可以(dmso) 320

12、微升孔代替异丙醇溶解细胞内mtt，在酶联免疫测定仪上于波长570nm或570nm,630nm双波特长测定吸光值并分析。 4. 3h-tdr放免测定待测细胞吸去培养液，每孔加入含，h-tdr培养液200ul（含发射量3.7x104bq)，在37孵育24小时后终止培养。以冷pbs 200ul清洗3次，加入4 10200ul，放入4冰箱30分钟，吸去酸，加入乙醚：（1：2)混合液200ul漂洗，吸去液体，晾干。加入0.4mo1/l naoh溶液200微升孔溶解细胞，在56恒温箱中放置2小时，吸出所有液体注入含有5m1闪耀液的闪耀瓶中，加盖摇匀，放置2小时后举行液闪测定。 【注重事项】 1平滑肌细胞取材广泛，但以年幼动物的血管较易培养成活。血管的新奇程度也非常重要，新奇的血管，易于培养胜利，取材时快速将游离的血管置于hanks液或培养液，并在2小时内举行分别培养。 2将血管的内、外膜彻底剥离整洁是保证培养细胞纯度的关键。剥离时，动作要轻柔，尽量削减组织损伤，弃去已夹过的组织。小牛血清质量与试验关系疏远。有条件可加入pdgf等细胞生长因子。游离细胞培养时还应注重胶原酶和弹性酶的纯度，以及酶的活性，以保证分别消化