心肌肌钙蛋白_的融合表达和分离纯化

1、心肌肌钙蛋白 的融合表达和分离纯化劳兴珍 1, 吴国球 2, 何 贝 斌绵 3, 沈子龙 3(1. 中国药科大学 生物信息学教研室 , 江苏 南京 210009; 2. 东南大学 附属中大医院 检验科 ,江苏 南京 210009; 3. 中国药科大学 生物技术中心 , 江苏 南京 210009 摘 要 :目的 研究人心肌肌钙蛋白 (cTn 在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化 , 以满足临床诊断 的需要 。 方法 人 cTn DNA 序列由 pd f 52cTn 质粒经 PCR 亚克隆而得 , 然后将其插入 pET 32a (+ 载体 , 构建成pET 32a (+ 2cTn 表达质粒 ,

2、 以大肠杆菌 BL21(DE3 为表达菌 , 在 IPTG 诱导下进行表达 。 硫氧还蛋白 (T rxA 2cTn 融合蛋白得到高效表达 , 并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质 白质具有 cTn 免疫原活性 。 结论 构建了 pET 32a (+ 2cTn 重组质粒 , , 为建立急 性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础 。 关键词 :心肌肌钙蛋白 ; 融合表达 ; ; 中图分类号 :R542.22; R786 21678(2006 0320150203coli and affinity puri fication of troponin ing 2zhen 1, W U G uo 2qi

3、u 2, HE Y un 2mian 3, SHE N Z i 2long 3(1. o f Bioinformatics o f China Pharmaceutical Univer sity , Nanjing 210009, China ;2. Department o f Laboratory , the Affiliated Zhongda Hospital o f Southeast Univer sity , Nanjing 210009, China ;3. The Biotechnology Center o f China Pharmaceutical Univer si

4、ty , Nanjing 210009, China Abstract :PurposeThe present w ork was to express a stable heterolog ous human cTn fusion protein toT rxA as part of an overall strategy for the is olation and purification of enough material for use as a diagnostic calibrator. Methods The DNA sequence was is olated from t

5、he cDNA plasmid pdf 52cTn by PCR and cloned as a fusion to the C 2termius of T rxA and the recombinant cTn expression vector was constructed and ex 2pressed in host E. coli BL21(DE3 . R esults When induced with IPTG,the pET 32a (+ 2cTn was highly expressed in E. coli . The fusion protein was affinit

6、y 2purified over a Histrap C olumn. The troponin fusion protein was assayed and found to exhibit similar immunogenic response relative to natural cardiac troponin . Conclusion The results dem onstrated that T rxA 2cTn was success fully expressed. The recombinant cTn was applicable in early detection

7、 of acute my ocardial in farction.K ey w ords :cardiac troponin ; fusion expression ; IrxA ; acute my ocardial infarction ; affinity purifica 2tion收稿日期 :2005210218; 修回日期 :2005212214作者简介 :劳兴珍 (19782 , 女 , 广西灵山人 , 硕士 , 助教 , 主要研 究方向为微生物与生化药学 ; 沈子龙 (19402 , 男 , 通讯作者 , 教授 , 博 士生导师 , 主要研究方向为微生物与生化药学 ,T el

8、 :025283271389。 1995年美国 FDA 批准心肌肌钙蛋白 (cTn 作为急性心肌梗死 (AMI 的最新实验诊断指标 。与其它指标相比 ,cTn 在血中出现持续的时间长 , 且 为心肌细胞所特有 。在心肌细胞膜完整的情况下 , cTn 不能透出细胞膜进入血循环 。当心肌细胞因 缺血 、 缺氧发生变性坏死时 ,cTn 可通过破损的细胞膜释放入血 。 由于 cTn 相对分子质量 (M r 较小 并持续从变性细胞中溢出 。因此对 AMI 诊断敏感 性高 , 特异性强 , 还可用于 AMI 的后期监护 、 预后及 疗效判断 1。 用传统的分离方法从人心肌组织中提 取 cTn 是非常困难的

9、 。为此 , 我们以 pET 32a (+ 为 cTn 克隆基因的表达载体 , 在大肠杆菌中经诱 导后高效表达出 T rxA 2cTn 融合蛋白 , 为制备高质 量质控产品及建立相关的检测方法打下基础 。 1 材 料pdf 52cTn I 质粒 , 中国药科大学生物技术中心51中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochem ical Pharmaceutics 2006年第 27卷第 3期构建 ;pET 32a (+ , 美国 N ovagen 公司 ;JM109、 BL21 (DE3 , 中国药科大学生物技术中心保存 ; dNTP 、 10 PCR 反应缓冲液 、 T

10、 aqDNA 聚合酶 、 限制性内切酶 , 上 海生工生物技术 有 限 公 司 ; T 4DNA 连 接 酶 , 美 国 Promega 公司 ;cTn T est K it , 美国 C ortea Diagnostic 公 司 ;HisT rap kit ,Amersham 公司 ;Am pgene 4800PCR 仪 , 北京昊诺斯科技有限公司 ; 其它试剂均为国产或进 口分析纯 。2 方 法2. 1 pET 32a (+ 2cTn 质粒的构建 2人 cTn DNA 序列由 pdf 52cTn 质粒经 PCR 亚 克隆而得 。 PCR 的条件为 :pd f 52cTn 模板 1L , 1

11、0bu ffer 5L ,10m ol/L dNTP 1L ,T aq Plus 0. 5L , 引物各 1L , 最后加 1滴石蜡油 , 置于 PCR 仪 ,95 5min 变 性 后 , 执 行 94 1min , 56 , 1min 程序 ,25个循环后 721. 2%设计有 Eco R , 先用 Eco R 和 Hin d 酶切 PCR pET 32a (+ 质粒 , 分别回 收片段和载体 , 将此片段和载体按适当的比例进行 连接 , 并转化至 JM109宿主菌中 , 经挑选得到阳性重 组质粒 , 命名为 pET 32a (+ 2cTn 。2. 2 pET 32a (+ 2cTn 的表

12、达将重组质粒转化至 BL21(DE3 菌种 ,37 培养 过夜 , 以 1%的接种量转接 , 培养至 A 600nm 值为 0. 6 0. 8时 , 加入终浓度为 1mm ol/L IPTG 进行诱导表 达 。 培 养 4h 后 , 离 心 收 集 菌 体 , 使 用 12%S DS 2 PAGE 检测目的蛋白质 。2. 3 T rxA 2cTn 融合蛋白的亲和纯化2. 3. 1 蛋白质初提物的提取 将菌体悬浮于 20 mm ol/L T ris 2HCl (pH 8. 0 、 0. 5mm ol/L E DT A 缓冲液 中 。 冰 水 浴 上 超 声 裂 菌 。待 菌 液 黏 度 下 降

13、后 ,10000r /min 离心 10min 收集菌液上清 。2. 3. 2 HisT rap kit 亲和色谱 将细胞裂解液上清上 样于已用平衡缓冲液 (pH 8. 0, 20mm ol/L T ris 2 HCl ,10mm ol/L 咪唑 预平衡过的亲和柱 。上样完 毕后 , 先用平衡缓冲液 充分洗柱 , 后分别用含 20, 40,60,100,300,500mm ol/L 咪唑的 20mm ol/L T ris 2 HCl (pH 8. 0 进行分步洗脱 。取少量供试品进行电 泳分析 。2. 4 以肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测目的蛋白 质免疫活性将菌体裂解液上清直接上样于测试板的小孔

14、 内 , 同时含 pET 32a (+ 的 BL21(DE3 同样进行细胞 破碎 , 并将菌体裂解液上清作为阴性对照 。3 结 果3. 1 pET 32a (+ 2cTn 表达载体的构建将 cTn 基因克隆入 pET 32a (+ 的 Eco R 和 Hin d 位点 , 通过铺板 、 培养 、 扩增 、 酶切等操作初选 出阳性克隆 , 酶切图谱见图 1, 重组质粒由上海生物 工程有限公司进行测序 , 结果与预期序列一致 。(Eco R +Hin d ; 2. pET 32a (+ 2cTn 重组质粒 以 Eco R +Hin d 进行双酶切 ; 3,4. pET 32a (+ 2cTn 重组

15、质粒分 别以 Eco R , Hin d 进行单酶切1. DNA markers (Eco R +Hin d ; 2. pET 32a (+ 2cTn recombinant plasm id digest by Eco R and Hin d ; 3,4. pET 32a (+ 2cTn recombi 2 nant plasm id digest by Eco R , Hin d ,respectively图 1 pET 32a (+ 2cTn 重组质粒的酶切分析Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET 32a (+ 2cTn r

16、ecombinant plasmid3. 2 目的蛋白质的诱导表达和纯化挑取重组菌单菌落在 LB 中 37 培养过夜 , 以 1%的接种量转接 , 培养至 A 600nm 值为 0. 60. 8时 , 加入终浓度为 1mm ol/L 的 IPTG, 继续培养 4h 后 , 离心收集菌体 , 使用 12%SDS 2PAGE 检测目的蛋白 质 。 电泳结果显示 :与对照组相比 , 发现有新的蛋白 质条带产生 (图 2 。观察发现 , 加入 IPTG 诱导后 , 转入空载体的细菌总蛋白质提取物中出现 1个 M r 为 20000的新蛋白质 , 而转入重组质粒 pET 32a (+ 2 cTn 的细菌

17、总蛋白质提取物中出现的新蛋白质 M r 为 44000左右 。 分析认为 , 空载体上产生的蛋白质 是 T rxA , 而重组质粒 pET 32a (+ 2cTn 质粒中产生 的蛋白质是 T rxA 2cTn 融合蛋白 。进一步的分析证 明目的蛋白质大部分以裂解液上清形式存在 。 结果 表明载体构建成功 , 而且适用于蛋白质的高效可溶 性表达 。细胞裂解液上清经亲和柱分步洗脱后 , 纯化的 T rxA 2cTn 融合蛋白主要位于 300mm ol/L 咪唑洗脱 峰中 , 达到电泳纯 (图 3 。3. 3 T rxA 2cTn 的免疫活性阳性菌落经 IPTG 诱导后 , 离心得到菌体并破碎 获得

18、上清后 , 由肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测到 151中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochem ical Pharmaceutics 2006年第 27卷第 3期cTn 蛋白免疫原活性 (图 4 。证明了目的蛋白质得到正确表达 。1. 诱导前全菌 ; 2. 含 pET 32a (+ 质粒的诱导后全菌 ; 3. 含 pET 32a (+ 2cTn 重组质粒的诱导后全菌 ; 4. 中 M r 标准蛋白质 1. Uninducted lysate of BL21; 2. Inducted lysate of BL21DET32a (+ ; 3. Inducted lysa

19、te of BL21pET32a (+ 2cTn ; 4. Protein marker 图 2 Fig 2 S DS 2PAGE analysis of protein before induction 1. 中 M r 标准蛋白质 ; 2. 纯化的 T rxA 2cTn 融合蛋白 1. M edium protein marker ; 2. Purified T xA 2cTn fusion protein图 3 纯化蛋白质的电泳分析Fig 3 S DS 2PAGE analysis of purified fusion protein4 讨 论本文采用的原核表达载体 pET 32a (+

20、 , 含 T 7启动子和转录终止信号 , 其特点除了能够编码 6个 组氨酸残基外 , 还带有大肠杆菌硫氧还蛋白 (T rxA 基因 。 T rxA 基因编码 109个氨基酸的硫氧还蛋白 。 硫氧还蛋白是低 M r 的氧化还原酶 , 在蛋白质折叠 过程中可催化二硫键的正确形成 , 对大肠杆菌表达 的重组蛋白质正确折叠更为有效 , 从而增加蛋白质 的可溶性 324。外源基因经多克隆位点插入后与 T rxA 一起融合表达 , 外源蛋白质与硫氧还蛋白融合 表达不仅提高了表达产物的稳定性 , 而且由于 M r1. 以含 pET 32a (+ 质粒诱导后菌体的破碎后上清为阴性对照 ; 2.含重组质粒诱导后

21、全菌体的破碎后上清1. Inducted lysate of BL21pET 32a ( as native control ; 2. Inductedlysate of 32a (+ 2cTn 4 assay of fusion proteinS 2分析时更容易鉴定 。此外 , 外源别位点 , 从而使外源蛋白质与硫氧还蛋白的分离变 得方便 。游离的 cTn 在血液中很不稳定 526, 易降解 , M r 较小 , 因此把 cTn 基因融合在 T rxA 基因的下 游 , 表达成较大 M r 的融合蛋白质 , 增加其稳定性 。 这一目的蛋白质在大肠杆菌中得到高效表达以及快 速纯化 , 为以后制

22、作 E LIS A 快速诊断试剂盒奠定了 基础 。 参考文献 :1 Wu A H ,Feng YJ ,John H C ,et al. C om paris on of my oglobin ,creatinekinase 2M B ,and cardiac troponin for diagnosis of acute my ocardial in farction J.Ann Clin Lab Sci ,1996,26(4 :2912300.2 M ark H ,Linda T ,Julie W ,et al. Expression in E scherichia coli andaffinity purification of a CK S 2T roponin fusion protein J.Protein Express Purif ,1995,6(3 :2562264.3 LaVallie E R ,Diblasio E A , K ovacic S ,et al. A thioredoxin gene f