分离产淀粉酶芽孢杆菌

1、微生物学设计性实验报告实验项目名称从壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 成 员 _专 业 _班 级 _指导教师 _从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。4、要求根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。二、实验材料1、土壤样品实验前一周在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒

2、头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样2、培养基富集培养基,即16g的可溶性淀粉，蛋白胨5g， NaCl 5g；选择性培养基，即可溶性淀粉 16克，蛋白胨5g，NaCl 5克，琼脂20克，葡萄糖6克（培养及含量均为每升）。3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿5、其他设备及仪器pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、接种环等三、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。2、在只用淀粉充当碳

3、源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90 C温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。4、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为芽孢杆菌。5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平

4、板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。四、实验步骤1样本采集在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。2目的菌株的富集取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g， NaCl 0.625g，调节pH值为7.0-7.2。在37摄氏度摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。在85-90水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。3. 选择性分离10、10、10、10， 将菌液上清分别稀释成10、分别取菌液0.2ml-1-3-4-5

5、-6均匀涂布在十个含葡萄糖的淀粉培养基上，在37摄氏度培养箱培养1天，平板培养基表面便形成了若干分散的单菌落。4、制片检测取其中平板培养基表面形成了若干分散的单菌落的平板，用卢戈氏碘液检测，根据有无淀粉水解圈来判断其有产淀粉酶能力，观察水解圈大小及菌落特征。挑取对照板中菌落特征相同的菌落点，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。5、纯培养取其中是芽孢杆菌的相应菌点种落接到淀粉平板上纯培养，在37摄氏度培养1天（每一种菌接点两处进行对照）。6、培养后观察各菌落形态特征取其中一块板分别滴加鲁戈氏碘液，观察淀粉水解圈大小，挑取对照板中的菌落通过简单染色制片观察，判别所选菌落是否为芽孢杆

6、菌。7、保藏菌种在斜面淀粉培养基的试管上标上菌株名称和接种日期后进行接种，待菌种生长完全后，至于4左右的冰箱中保藏。五、时间安排6日上午：取样6日下午：富集培养，配制培养基并灭菌（另包括培养皿，移液管，试管等），倒平板，配制保藏菌种的培养基8日下午：杀死菌体，稀释菌液，接种芽孢9日下午：检测，染色制片观察，点种转接10日下午：检验所选菌种并保藏六、实验结果1、稀释后接种芽孢的平板上长出分散的单菌落，滴加碘液后有变色圈，其菌落特征为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙有褶皱。2、显微图片一株为杆状，细长，中间或近似中间部位有芽孢，一株为球状，-4双生，均为革兰氏阳性（其中一株为10的平板上的菌，24

7、h后菌落直径为9mm，-3变色圈半径/菌落半径=1.43，一株为10的平板上的菌，菌落极小，无法观察形态,但是变圈很大）。3、 点种后的菌落形态扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙有褶皱，有水解圈，滴加碘液后有变色圈。4、最终得到两株两株目的菌株。 七、分析或讨论1、杀灭菌体时，温度控制不够好。温度应该是80-90 C10分钟，可当时我们是在70 C左右便把菌悬液放入到了水浴锅中，但是实际上，刚形成的芽孢总是处于休眠状态。热处理（如65放置几十分钟）可以使芽孢加速活化，提前放入水浴锅中可能使一部分芽孢刚刚萌发便被杀死，造成菌悬液中的芽孢数量减少。2、接种时跳过10的浓度，浓度选择不够合理。稀释菌悬液时，跳过10-1-3-2-2的浓度，但是实验结果是，10的平板上菌落太多，不能准确观察，10的平板上菌落偏少，10是最好的浓度。下次实验时应该注意在不能准确定接种的情况-2下应该多接种几组，不能怕麻烦。3、培养基中加入葡萄量颇多，导致细菌利用较多利用葡萄糖，产生的淀粉水解圈不明显。培养基中加入葡萄糖，原因是芽孢萌发时加葡萄糖以利生长，但是可能是当时加入葡萄糖的量偏多，使不能利用淀粉的细菌芽孢也萌发，致使有较多杂菌不利于检验，同时又使可利用淀粉的细菌芽胞萌发成营养细胞后利用葡萄糖，而不是利用淀粉，致使产生的淀粉水解圈太小。下次实验时应注意仔细查阅资料及询问老师，控制