再生障碍性贫血患者的T淋巴细胞研究进展

1、    再生障碍性贫血患者的T淋巴细胞研究进展        再生障碍性贫血(再障)是骨髓造血功能衰竭导致全血细胞减少的疾病。大量研究结果表明，再障患者骨髓造血功能衰竭的发生、发展与免疫机制，特别是T 淋巴细胞数量及功能的异常密切相关1,2。我们就再障患者T淋巴细胞的研究进展作一综述。 1再障患者T淋巴细胞数量及亚群的变化再障患者外周血淋巴细胞的比例相对增高，他们的骨髓造血组织被脂肪组织或其它非造血细胞所代替, 淋巴细胞在骨髓穿刺液中所占的比例明显增高。再障患者骨髓活检标本中

2、CD3+淋巴细胞亦明显增多3。再障患者CD8+T淋巴细胞所占的比例增加,CD4+T淋巴细胞的比例减少,CD4+/CD8+比值降低。Viale等4用有限稀释法对重型再障(SAA)患者骨髓和外周血的T淋巴细胞进行了集落培养,结果表明SAA患者骨髓和外周血的CD8+T淋巴细胞集落明显高于正常人。Maciejewski等5研究表明再障患者 TCR+-T淋巴细胞高于对照组。2再障患者T淋巴细胞功能的变化2.1再障患者T淋巴细胞处于激活状态:近年来,激活的T淋巴细胞的变化及其与再障发病的关系受到普遍重视。Maciejewski等5发现再障患者骨髓和外周血中HLA-DR+CD8+T淋巴细胞较正常及骨髓增生异

3、常综合征(MDS)患者明显增高,而接受免疫抑制治疗的SAA患者恢复期HLA-DR+CD8+T淋巴细胞下降。再障患者骨髓与外周血中T淋巴细胞的变化并不完全一致，部分再障患者仅在骨髓中检测到HLA-DR+CD8+T淋巴细胞。因骨髓穿刺液中难免有外周血混入,故用这种标本所作的研究不能完全反映骨髓局部T淋巴细胞的改变。最近Melenhorst等3用定量免疫组化方法分析了再障患者骨髓活检标本,6例患者中5例骨髓活检标本的造血残留区中CD3+T淋巴细胞显著高于对照,而且CD4+与CD8+细胞均增高,比值接近1。为分析T淋巴细胞的活化状态,他们还检测了颗粒酶B-7(GB-7),结果发现GB-7+细胞显著增高

4、,提示该组再障患者中T淋巴细胞处于活化状态。这种T淋巴细胞选择性定位于靶器官或局部活化增殖的证据进一步确立了T淋巴细胞在再障发病中的重要地位。再障患者骨髓内活化状态的T 淋巴细胞的增加可能是再障免疫病理机制的生物学基础。2.2再障患者T淋巴细胞分泌功能:T淋巴细胞可产生多种细胞因子,既有造血刺激因子,又有造血负调控因子,以维持正常的造血活动。再障患者由于T淋巴细胞亚群及功能的变化,淋巴因子的分泌失调,可产生过量的造血负调控因子,从而表现出明显的造血抑制活性。再障患者的血清及单个核细胞培养上清中白细胞介素2(IL-2)水平升高,且部分患者单个核细胞可自发产生IL-2。用外源性rhIL-2能够抑制

5、红系爆式集落(BFU-E)的生长,说明IL-2的异常与再障的造血抑制有关。有人通过体外实验发现重组人-干扰素(rhIFN-)对BFU-E、红系祖细胞集落(CFU-E)和粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)的生长起抑制作用,且为浓度依赖性抑制。再障患者骨髓内的T淋巴细胞不经预先刺激即可自发产生IFN-、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF-)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1等造血负调控因子。外周血T细胞必须经绵羊红细胞刺激后才能释放细胞因子,而正常人的T淋巴细胞需要更强的致丝裂原的刺激下才能释放细胞因子6。 再障患者的T淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后较正常人T淋巴细胞更易产生上述因子。Nistico

6、等7研究了25例再障患者及39例其他血液系统疾病患者和20份正常对照的骨髓及外周血IFN-基因表达的情况,发现18例SAA中14例骨髓标本中可检测到IFN- mRNA的表达,无论是健康对照及其它慢性贫血需经常输血者或化疗后全血细胞减少或MDS患者骨髓中均无IFN- mRNA的表达。Nakao等8研究发现再障患者不经体外刺激的骨髓IFN-基因表达对预示环孢霉素A(CsA)治疗反应好有一定意义。上述研究结果提示骨髓局部高浓度抑制性细胞因子与再障的发病有关 。3再障患者T淋巴细胞的生物学特点3.1再障患者HLA型别特征:T淋巴细胞识别抗原肽是主要组织相容性抗原复合物(MHC)限制性的。已证实HLA-

7、DR2与多种自体免疫性疾病的发病有关。对再障患者HLA的研究发现再障患者中HLA-DR2的阳性率明显高于正常人群9，提示HLA-DR2与再障密切相关。HLA-DR2阳性患者,对免疫抑制治疗疗效好10。Nakao等11用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析了26例CsA治疗有效再障患者(其中13例为CsA依赖者)的HLA-类抗原DRB1、DQA1及DQB1等位基因的型别, 发现13例CsA依赖者具有共同的HLA-类单体型DRB1.1501-DQA1.0102-DQB1.0602 。PCR-单链构象多态性(SSCP)分析显示了其第2外显子无核苷酸序列多态性,而非CsA依赖

8、者则无一例具有上述血清学型别及DNA分型之别。这表明部分HLA-DR亚型对CsA 疗效有预测作用。这些发现提示与CsA疗效有关联的T淋巴细胞异常可能与遗传特性(再障易感性)相关。3.2再障患者T淋巴细胞受体(TCR)的表达状态:有学者提出如果T 淋巴细胞能特异识别并破坏或抑制造血细胞,则应在其靶器官骨髓中观察到T淋巴细胞对某一抗原反应的克隆性增生。Manz等12用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法研究了再障患者骨髓及外周血TCR 链上的可变区(TCRBV)V 1V 24转录本的表达后发现,尽管V 表达的异质性高,但其中V 3、V 20、V 21及V 22亚家族在再障患者中的表达与正常对照比

9、较,至少增加3倍以上。另有学者用同样方法扩增骨髓T淋巴细胞TCRBV后行SSCP分析也发现相似结果13。这些结果从分子生物学方面提示免疫介导的再障患者有特异的、针对某些特定抗原的寡克隆T淋巴细胞的增殖。3.3再障患者T淋巴细胞株的建立及其生物学特征:既然部分免疫介导的再障患者的某些T淋巴细胞能特异识别骨髓中造血干/祖细胞并破坏或抑制它们的生长, 如能分离这些T淋巴细胞并稳定传代,就能利用它们鉴别出引起骨髓衰竭的靶抗原。Moebius等14从1例再障患者的外周血淋巴细胞克隆出一株CD4+CD8+T淋巴细胞。它对EB病毒转化的淋巴细胞具有杀伤作用,且这种杀伤作用能被CD3单抗和MHC-DP单抗所阻

10、断。体外实验证实这一淋巴细胞株通过直接的细胞介导机制能抑制自体骨髓造血祖细胞的分化。这说明对MHC-DP特异的CD4+CD8+T淋巴细胞克隆可能与某些再障的骨髓衰竭有关。Nakao等15从1例CsA依赖的复发再障患者骨髓单个核细胞中建立了29个T淋巴细胞株,其中部分CD4+T淋巴细胞株与自身富集的CD34+细胞共同培养时表现出良好的增殖性能,增殖性能最强的T淋巴细胞为V17(SN17)。SN17能产生IFN-，且与自身富集的CD34+细胞共同培养时能抑制CFU-GM、BFU-E的形成,抑制率达60，但并不清楚此抑制作用是否由特殊的HLA等位基因介导的免疫反应所致。最近Nakao等16又从另1例

11、CsA依赖的未曾接受输血的再障患者(其HLA-DRB1等位基因包括1501*和0405*)骨髓单个核细胞中分离到16个CD4+细胞株。经PCR扩增TCRBV后SSCP分析，其中有3 个V 21+的细胞株具有相同的特性,提示这些细胞株的起源相同,命名为NT4.2。对这些细胞株的进一步研究发现其表型为CD3+、CD4+、CD8-、CD56+。NT4.2细胞株体外表现出强烈的细胞毒性,能直接攻击自体CD34+细胞,并能裂解EB病毒转化的自体淋巴细胞株(LCL)、具有相同的HLA-DRB1*0405的PHA刺激的淋巴细胞及异体CD34+细胞。NT4.2细胞株还能强烈地抑制自体及异基因HLA-DRB1*

12、0405 CD34+细胞的集落形成。上述作用可被抗HLA-DR单抗及抗CD3单抗阻断,提示它的细胞毒作用具有 MHC限制性及HLA-DR依赖性,该淋巴细胞是通过识别造血细胞上HLA-DR4提呈的肽片段而杀伤造血细胞。这进一步支持了部分再障患者T 淋巴细胞可能被某一抗原激活后增殖, 并识别具有该抗原表达的造血细胞而发生的自体免疫反应导致骨髓衰竭。3.4再障患者T淋巴细胞的凋亡状态:激活的T 淋巴细胞死亡对调节免疫反应起极为重要的作用,激活的T淋巴细胞可在多种情况下发生凋亡。T淋巴细胞有一种特殊的凋亡形式，称为激活诱导的细胞死亡(activation induced cell death,AICD

13、),即当T淋巴细胞的表面分子TCR/CD3被激活后,若其再次受到刺激时,便发生AICD。AICD主要通过Fas抗原与其配体Fas-L参与免疫反应过程中淋巴细胞数量的调控17,淋巴细胞被抗原激活后也开始表达Fas-L。而Fas在成熟T淋巴细胞中就有基础表达,在激活的T淋巴细胞表达增加。Fas和Fas-L的同时表达使激活的T淋巴细胞在其发挥功能后立即凋亡,从而避免对机体的损伤。再障患者体内激活的T淋巴细胞增多是否与T淋巴细胞未能及时而有效地凋亡有关,目前还不清楚。最近Genestier等18研究发现,抗胸腺细胞球蛋白(ATG)可增加激活的T淋巴细胞上Fas-L的表达,并通过Fas/Fas-L诱导激

14、活的淋巴细胞发生凋亡。4再障患者T淋巴细胞对体外骨髓细胞培养的影响早期的实验中即发现将再障患者的骨髓单个核细胞进行体外培养时其集落形成数显著减少,去除了骨髓单个核细胞中的T淋巴细胞后集落形成数明显增加。当用再障患者的外周血单个核细胞与正常人骨髓细胞共同培养时,集落形成数亦显著减少,提示再障患者的T淋巴细胞对正常人的骨髓造血祖细胞的集落产率有抑制作用。在再障患者骨髓单个核细胞培养液中加入抗IFN-抗体,集落形成数增加。有人观察到再障患者外周血T淋巴细胞与正常骨髓造血细胞共培养时能抑制CFU-E的生长,而正常人T淋巴细胞则无此抑制作用19。这些事实说明,T淋巴细胞可通过直接作用或由其分泌的细胞因子

15、而抑制骨髓细胞的生长。5再障患者T淋巴细胞与造血细胞凋亡的关系再障患者的骨髓涂片和活检形态学均表现为造血细胞减少。有人用流式细胞仪检测再障患者CD34+细胞的变化,亦发现再障患者骨髓内CD34+细胞数较正常显著减少20。Maciejewski等21测定了41例再障患者与40名正常人细胞Fas受体的表达,结果再障组CD34+细胞的Fas抗原(CD95)表达明显高于正常对照组。体外实验结果表明,再障患者T淋巴细胞高分泌TNF-和IFN-等,而TNF-或IFN-可诱导正常人骨髓CD34+细胞Fas表达的增高。再障患者体内高水平的IFN-及TNF-也可诱导其CD34+细胞上Fas抗原的表达增加。Fas

16、基因产物是一种膜蛋白,也是一种受体,伸向胞浆的部分有一段与TNF受体相似,属TNF受体家族成员。Fas的配体Fas-L是型膜蛋白,属TNF家族成员,当Fas-L与Fas结合时,Fas可向细胞内传递“死亡信号”,致细胞发生凋亡,CD34+细胞暴露于以上造血负调控因子后,可检测到与凋亡有关的DNA降解片段22。总之,再障骨髓衰竭的发生可能与T淋巴细胞高分泌TNF和IFN等因子,进而上调Fas及Fas-L途径的凋亡有关。新近Nishii等23报道了用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及大剂量红细胞生成素(Epo)治疗1例老年再障患者获得成功,体外试验显示大剂量Epo可阻止该患者骨髓单个核细胞发生凋亡。

17、6临床疗效及动物试验6.1抗T淋巴细胞治疗再障有效:ATG/抗淋巴细胞球蛋白(ALG)是用人的胸腺细胞/淋巴细胞免疫动物后获得的免疫球蛋白复合物,它们对T淋巴细胞的细胞毒性及调节作用可导致短时期内淋巴细胞减少,它们单用于治疗再障,能使约50的患者康复。CsA是一种更为特异的免疫抑制剂,它对淋巴细胞不是通过细胞毒作用,而是抑制淋巴细胞的功能,包括淋巴因子的产生及淋巴细胞的增殖, 它能使ATG难治的再障患者中约50的患者康复。联合应用ATG/ALG、CsA和造血细胞生长因子(HGF)则使疗效提高到80以上,现已被认为是SAA的标准治疗方案,疗效可与骨髓移植相媲美24,25。6.2再障动物模型的建立

18、:Kang等26把CBA/J小鼠经采用137Cs 6Gy进行全身照射后,再输入取自C3H/He小鼠的胸腺及淋巴结混合细胞(LNC),诱导出小鼠的再障模型,且发现如果去除LNC中的T淋巴细胞,小鼠发生再障的可能性显著减少,去除LNC中的B细胞或单核细胞,对小鼠发生再障并无影响。这进一步证实了T淋巴细胞与再障发生有关。7小结综上所述,T淋巴细胞数量及功能的异常及其所造成细胞因子的分泌失调与再障发病密切相关。深入研究再障患者T淋巴细胞的异常表现、机制及成因对系统阐明再障免疫病理机制并进而指导治疗具有重要意义。作者单位:和虹邵宗鸿300020天津,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医

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