急性白血病原代细胞TGF-βⅡ型受体同种型的发现及其临床意义

1、急性白血病原代细胞TGF-型受体同种型的发现及其临床意义 08-03-10 11:07:00 编辑：studa20 作者：陈萍，陈元仲，吴勇，黄慧芳，李乃农【摘要】 转化生长因子（TGF-）及其受体的基因突变已被证实在肿瘤形成中具有重要的作用，在许多肿瘤中都发现有TGF-型受体（TR-）表达异常或表达缺失。为了了解急性白血病患者TR-基因是否存在异常，本研究应用大范围RT-PCR的方法分段扩增急性白血病原代细胞TR-的编码序列，并结合序列测定技术，分别对6例急性白血病患者以及11例正常人TR-的编码序列进行突变检测。全部患者经骨髓细胞形态检查符合FAB诊断标准且骨髓原始细胞90%。肝素抗凝骨髓

2、4-5 ml，分离单个核细胞，用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录后行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段，克隆到PGEM-T载体，进行序列的测定。结果显示：在检测的病人中有2例病人中存在TR-的同种型，而此2例病人临床预后不良。结论：部分白血病病人存在TR-的同种型，而且该同种型可能与预后有关。 【关键词】 急性白血病Identification of the Isoform in Type Receptor of Transforming Growth Factor-beta in Patients with Acute Leukemia and Its Clinica

3、l SignificanceAbstract Recent research indicates that TGF- and type receptor (TR-) play an important role in the pathogenesis of tumor. A high frequency of abnormalities in TR- has been demonstrated in various cancers.To identify the mutation of TR- in patients with acute leukemia，the bone marrow sa

4、mples from 6 patients with acute leukemia and 11 normal individuals as control were detected by long-range RT-PCR.To detect a deletion in sequence of the TR-gene，the PCR products were cloned to T vector and then sequenced.The results showed that there was existance of the isoform of TR- in 2 cases o

5、ut of 6 patients with acute leukemia.These two patients had more poor prognosis than others.In conclusion，there was the isoform of TR- in partial patients with acute leukemia，and the isoform may be related with prognosis.Key words acute leukemia; TR-; isoform receptorTGF-信号转导通路在调节多种细胞的增殖与分化、诱导细胞凋亡等方

6、面具有重要的作用，有研究表明这一通路的紊乱可以导致多种肿瘤的发生1 。TGF-受体（TR）有3种亚型即TR-、TR-和TR-，其中TR-和TGF-具有较高的亲和力，在TGF-介导的信号转导中起着重要的作用，在许多肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、人类表皮T细胞淋巴瘤患者中2-3均观察到TR-表达缺陷。目前对于急性白血病原代细胞是否存在TR-缺陷未见报道。本研究通过应用大范围RT-PCR技术分段扩增急性白血病原代细胞 TR-的编码序列，进行序列的测定，结合收集的病人的临床资料，初步探讨TGF-型受体（TR-）在急性白血病发病机制中所起的作用。材料和方法研究对象实验组6例，男5例，女1例，平均年龄4718

7、.6岁（30-66岁），为2003年4月-2004年2月福建医科大学附属协和医院血液科住院或门诊白血病病人，均为初治患者，其中急性淋巴细胞白血病2例（均为L2），急性非淋巴细胞白血病4例（M1 2例，M2 1例，M5 1例）按FAB分型诊断明确，其骨髓原始细胞90%。正常对照组11例，男9例，女2例，年龄287.2岁（21-35岁），均为健康供髓者。单个核细胞的制备采集骨髓，以肝素（40 U/ml）抗凝。加入37温浴的2%甲基纤维素(华美公司产品)至其终浓度为0.1%，混匀，于37、5% CO2 培养箱中静置30分钟，吸取上层有核细胞层，铺于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上层（华美

8、公司产品，比重1.077）（有核细胞层分离液=21），室温667g离心20分钟，吸取中间层细胞置于1/15 PBS，充分重悬，室温167g离心5分钟，弃上清，重复用PBS洗涤2次，用所得细胞提取RNA。细胞总RNA提取采用TRIZOL（Life Technology公司产品）提取总RNA，具体操作步骤详见说明书，经紫外分光度计测定浓度和纯度，A260/A280达到2.0，电泳可见清晰的28s及18s两条带，提示RNA结构完整，-70保存备用。逆转录反应反应体系25 l，内含细胞总RNA 2 g，M-MLV（Promega公司产品）200 U，dNTP 20 nmol，RNasin （Prome

9、ga公司产品）25 U，随机引物 （Promega公司产品）0.5 g，5逆转录缓冲液5 l（Tris-HCl 250 mmol/L，pH 8.3，KCl 375 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L，DTT 50 mmol/L）。37温育60分钟，95 5分钟终止反应，-20保存备用。PCR反应反应体系25 l参照文献4，采用高保真酶（NEB公司产品）。扩增条件：95预变性5分钟，后94变性50秒，62退火30秒，72延伸60秒，共35个循环，再72延伸10分钟。PCR引物由上海博雅公司合成。TR- 5 端编码序列(TGR5)上游引物为 5 -CTCGGTCTATGACGAGCAG-3；下游引物为5-ACGTGGAGCTGATGTCAGAG-3，扩增产物片段为720 bp。TR- 3 端编码序列(TGR3)上游引物为 5-CTGCCCATTGAGCTGGACAC-3；下游引物为5-CTCCAGCTCACTGAAGCGTTCTG-3，扩增产物长度902 bp。PCR产物纯化及测序回收PCR产物按割胶回收试剂盒说明书（上海生物工程公司）进行，将回收产物5 l加适量溴酚蓝及水点样电泳，电压5 V/cm，电泳30分钟后，在紫外检测灯光下，可见相应位置有条带。纯化