影响大豆子叶节再生的因素研究

1、第卷第期年月文章编号（）东北农业大学学报（）：影响大豆子叶节再生的因素研究李海燕，武小霞，韩英鹏，刘淼（东北农业大学大豆研究所，国家教育部大豆生物学重点实验室，哈尔滨）摘要：以大豆品种北京小黑豆的成熟种子为材料，研究了不同消毒方法、激素配比、外植体以及芽诱导时的诱导培养间对再生频率的影响。结果表明，使用氯气消毒法，以大豆子叶节为外植体，在基上诱导后，北京小黑豆能获得较高的植株再生率，每个外植体成苗数在个左右。关键词：大豆；子叶节；茎尖；激素；再生中图分类号：；文献标识码：大豆转基因的研究离不开大豆高效再生系统的建立。大豆再生系统已多有报道，如大豆体细胞胚发生再生系统，大豆不定芽器官发生再生系统

2、和原生质体再生系统。其中大豆的子叶节经器官发生途径诱导丛生芽再生植株，具有取材不受季节限制、生长快、不易发生变异、再生植株健壮等优点。尽管以子叶节为外植体作遗传转化时会出现嵌合体，但目前仍被认为是用于遗传转化较好的外植体。本文从大豆的消毒方法、激素配比、不同外植体以及芽的诱导时间对再生频率的影响进行了讨论，为建立高效稳定的大豆再生体系提供依据。干燥器内，混合次氯酸钠和盐酸于反应液容器中，消毒后用无菌水浸泡。待种子充分吸水，种皮软化后接种于萌发培养基上。每种方法处理粒种子，次重复。外植体及培养基取发芽生长的无菌苗切取胚轴、子叶节接种在萌发培养基上。萌发培养基的基本培养基（培养基的大量元素和微量元

3、素），为盐（培养基的铁盐），（培养基的有机物），蔗糖，琼脂粉，调至，在基本培养基上附加不同浓度的和，分别设个浓（有芽分化的外植体数接种的外植体度，以分化率数）×为指标，将外植体接种于芽诱导培养基上，每个处理瓶，每瓶个外植体，次重复。后统计每个处理的分化率和每个外植体芽数，探讨和，对丛生芽诱导的影响。材料与方法材料大豆品种北京小黑豆，由东北农业大学大豆所提供。方法种子消毒挑选健康无病害的大豆种子，采用以下两种种子消毒方法。升汞消毒法，大豆种子分别用洗涤剂、自来水、蒸馏水冲洗后，用酒精缓慢，无菌水冲洗摇动，升汞消毒次。氯气消毒法，在通风橱中将种子放于密闭的收稿日期：基金项目：国际科技合作

4、重点项目（大豆抗疫霉根腐病资源创新及主效与环境互作的研究）（）；大豆生物学教育部重点实验室主任基金项目（）作者简介：李海燕（），女，黑龙江人，讲师，主要从事植物基因工程方面的教学与研究工作。：结果与分析种子的消毒方法对北京小黑豆的种子进行两种不同消毒方法的比较发现（图），氯气消毒法相对升汞消毒法能够显著地降低污染率，提高分化率，二者的污染率分别为和。因为在记录数据时将发芽后污染的种子也一并计算在内，升汞消毒法中分化率也较高。在保持高分化率的前提下，将大豆种子的污染率降到最低，是大量获得无菌苗的基础，也是大豆组织培养能够正常、顺利进行的前提条件。因此，建议采用氯气消毒法作为大豆种子消毒的方法。东

5、北农业大学学报第卷表升汞（）子叶节不同放置方式对芽诱导的影响放置方式接种数（个）芽总数（个）分化率（）平放图升汞和氯气消毒的对比垂直半埋大豆外植体的选择在、四个浓度当子叶节平置于培养基上时，子叶节的分化率比垂直半埋于培养基上低，平放时的分化率是，垂直半埋的分化率是。但平放时，子叶节切段表现为生理极性现象，即在子叶节处长出芽后，在另一端逐渐分化出不定根，而且分化出的不定芽能在个月内始终保持浓绿色，而当子叶节垂直放在培养基上时，其下端只是膨胀，没有分化出不定根，若在周内不及时转移培养基，则不定芽逐渐变黄枯萎。采取垂直半埋这种放置方式有利于子叶节的分化。和，对子叶节不定芽的影响的浓度范围是如表所示。

6、表不同浓度对子叶节形成不定芽的影响下，对子叶节和胚轴的分化率进行比较。子叶节随着浓度的增加，分化率也逐渐增大，当在时分化率最大为，但随着浓度的继续增加，子叶节的分化率不增加反而下降为。同样胚轴也随着浓度的增加，分时分化率化率逐渐增加，但当在最大为。由表可知，子叶节与胚轴的分化率差别不大，子叶节和胚轴都可作为大豆再生体系的外植体。子叶节不同的放置方式影响外植体的分化。结果见表。表不同外植体对分化率的影响外植体浓度接种外植体数（个）分化率（）浓度外植体数（个）（）出芽率（）平均外植体成苗数（个）子叶节胚轴第期李海燕等：影响大豆子叶节再生因素的研究其中在浓度范围内，子叶节的出芽率较高，当为时最高，但

7、外植体的平均成苗数没有在为时多。综合比较后，为时对子叶节形成不定芽效果最好。如表所示，在、五个浓度范围进行比较。，为时，出芽率最高，而，为时，外植体成苗数最高。比较后选择，为作为最佳浓度。并且在加和，的培养基中的幼苗比较粗壮，不加和，的培养基大豆幼苗细且出现大量弯曲，加入的和，的培养基比不加的培养基在出芽数上有明显的区别。其和，的效果最中好，且的出芽数是，的出芽数是。所以，建议选择作为子叶节不定芽诱导激素。表不同浓度，对子叶节形成不定芽的影响，浓度外植体数（个）（）出芽率（）平均外植体成苗数（个）表诱导时间对出芽率的影响诱导时间（）出芽率（）外植体数（个）结论氯气消毒法是一种高效的种子消毒方法

8、，并且可以减少由升汞给人体造成的伤害。在大豆再生过程中，不同外植体诱导愈伤组织的能力不一样，以下胚轴和子叶节作为外植体进行植物体再分化比其它部位的外植体更适合，且子叶节诱导愈伤组织能力强于下胚轴。垂直半埋这种放置方式对子叶节诱导芽有较好的效果，且诱导出的愈伤组织有光泽，质量好。并且外植体接种方式影响根的发生。垂直半埋生根率大于平置，原因是垂直半埋固形态学下端埋于培养基中适合根的发生；从而促进根的发生，而平置在培养基上，不符合植物体形态学特点，从而抑制了根的发生。适合作为诱导大豆愈伤组织的基本培养基，激素条件为或，为时最合适，过高或过低的浓度激素均不利于愈伤组织的诱导和生长。在诱导培养基上诱导时间为时，大豆的出芽数最高。符合以上条件可以提高大豆再生的筛选工作效率。参考文献诱导时间对出芽率的影响诱导培如表所示，在养基上摆放外植体。不同的诱导时间，对苗的出芽率有明显的影响。随着时间的延长，出芽率增大。当诱导时间为时，出芽率较高。随着时间的延长，出芽率没有明显的变化。为了节省试验时间，需要在最短的时间内挑选出试验材料，所以，建议在第五天把材料取出，进行下一步试验。王晓春，刘尚前，王罡，等大豆体细胞胚再生植株的研究大豆科学，（）：李海燕，朱延明，刘北东，等大豆幼胚子叶体细胞胚诱导主要影响因