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文档简介

1、应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA: 5-GCCTAACGTAAC-3。DNA化学合成时由3端向5进行。合成原理步骤如下:1.脱保护基:用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基,获得游离的5-羟基端,以供下一步合成反应。2.活化:将质子化的核苷3-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱,形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5端仍受DMT保护,3端被活化。3.连接:二步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸,与核苷酸的5-羟基发生亲核反应,缩合并且脱去四唑,此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基。4.氧化:缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CP

2、G上的寡糖核苷连接,而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂,得到稳定的寡糖核苷酸。经过上述几个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上,再采取上述同样的步骤,即可得到一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基。具体则是用苯硫酚除去5-OH上的保护剂DMT,用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开,使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去,最后除去氢氧化铵,在真空中抽干。DNA纯化分离:利用HPLC或者PAGE对得到的粗品进行纯化分离,得到所需的DNA分子。DNA序列鉴定:检定D N A 片段的顺序的方法主要有两

3、种: (1wandering SPot方法,主要适用于适用于寡核苷长度在20个碱基以下的片段;(2化学裂解法,该法核苷酸碱基顺序从凝胶的放射自显影图谱上直接读出,但对于合成产物中少量的不纯物是检测不出来的;具体步骤:各种基团的保护方分别如下图所示:(1戊糖的保护 (2碱基的保护 在本题中保护后的碱基A、C、G分别简记为Ba、Bc、Bg、Bt。因为T无需保护,为书写方便简记为Bt。(3磷酸酯基的保护:具体合成步骤如下: 如此不断重复,最后得到一条DNA分子的长链,其结构如下: 得到粗产物后再利用电泳或者HPCL技术加以分离,回收片段最长的。DNA的鉴定经分离纯化后的DNA寡核苷酸片段,应对其质量(包括长度和核苷酸顺序进行检定。检定DNA片段的顺序的方法:采用wandering SPot方法,适用于寡核苷酸长度在20个碱基以下的片段。寡核苷酸片段5一端经一32P-ATP用T4多核苷酸激酶标记后,经蛇毒磷酸二醋酶进行部分水解,标记混合物于pH=3.5的条件下在醋酸纤维纸上进行电泳,然后在DEAE一纤维素板上进行同系层析,寡核苷酸的顺序通过这一标记消化产物的特定迁移率来测定。此方法的好处在于不仅可测出寡核苷酸的顺序,也可以检出不纯物的污染。参考文献:1.生物化学教材,古练权,高等教育出版社2.DNA的化学合成及其应用,静

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