实时RT_PCR基因表达相对定量REST_软件分析与2_CT_法比较

1、文章编号（）基础研究论著）实时基因表达相对定量"软件分析与（法比较庾蕾，刘建平，庄志雄，杨淋清，张仁利，叶小明，程锦泉（深圳市疾病预防控制中心分子生物学研究室，深圳；华中科技大学同济医学院公共卫生学院，武汉）摘要】目的【利用实时技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株（）为模板倍系列稀释，分别作聚合酶（）和磷酸甘油醛脱氢酶（）基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘（）诱导的、转化的及肺癌细胞株（）为模板，进行实时定量。以基因作为内参照，进行基因表达）相对定量。实验数据分别采用（法及"软件分析。结果倍系列稀释法制作的标准曲线，呈现较好）

2、法计算出的表达的线型关系（）。及基因扩增效率分别为和。采用（结论比值均比"软件分析高。定量分析手段。实时技术结合"软件分析是一种简便、准确的基因表达相对关键词】实时；相对定量；标准曲线；基因表达【中图分类号：文献标识码：）!（，（，；，）【】（）"（），（""【】；分子流行病学研究中一个非常重要的内容，就是在群体研究基础上，从分子或基因水平探索疾病的病因和发病机理。目前，实时已成为基因表达定量的强有力的工具，具有高敏感、重复性好及定量范围广的特点，特别是定量低丰度的及揭示微小的基因表达变化。由于其操作简单而被广泛应用，但传统的（!）法定量误差大

3、。本文介绍了一种简便、准确的基因表达相对定量实时方法包括标准曲线的制作及实验数据的处理。基金项目：深圳市科技计划项目（）。作者简介：庾蕾（），女，博士，副主任医师，主要从事生物化学与分子毒理学研究。材料与方法材料采用的细胞株为永生化人支气管上皮细胞株（）。通讯作者：程锦泉，博士，主任医师，：热带医学杂志年月第卷第期、转化的及肺癌细胞和纯品由广州医学院化学致癌研究所纪卫东博士赠送。方法细胞培养及诱导个样本设个复孔，同时设置无模板对照（）。以基因作为内参照，进行基因表达相对定量。仪器软件（公司产品）自动分析给出基因相对表达量）（）或表达比值（）。细胞用含小牛血清的培养液培养。诱导：储存液（溶解）用

4、含小牛血清的培养液稀释成终浓度分别为、的溶液。待细胞长至数据分析实验数据分别采用下列种方法分析。）法：仪器软件自动分析给出表达比值，使用（统计软件进行方差分析；%软件分析：在相应界面输入标准曲线及基因表达相对定量值，软件分析给出表达比值及统计分析结果。融合时，弃上清，加入含的培养液，诱导，用洗次，细胞按传代，待细胞长至融合时，再加诱导，共次，以小牛血清培养液作为对照。结果标准曲线的构建以正常为模板，分别采用倍、倍及。总提取收集细胞，用试剂（公司产品），按照试剂盒操作步骤提取总合成以各处理组的总为模板进行逆倍系列稀释制作和基因标准曲线，结果表明倍系列稀释呈现较好的线型关系（）。转录反应。采用试剂

5、盒（公司）。反应缓冲体系含随机引物（）逆转录酶（）、酶抑制剂、及基因扩增效率分别为、和，基本一致（图，图）。荧光值（）、各及总。于仪（，公司产品），。实时定量基因表达分析探针及引物设计基因表达分析的引物、探针用软件（公司产品）设计（表），由上海基康生物技术公司合成。表基因表达分析的引物探针序列循环数基因引物（）探针（）图标准曲线的扩增曲线值（）：代表，代表基团实时定量采用试剂盒（公司产品）。反应缓冲体系含引物各、探针、参考染料及。反应在荧光定量仪（公司产品）上进行。反应条件：预变性，再，个循环。初始模板相对定量值标准曲线的制作以正常为模板，图基因标准曲线分别进行、倍比稀释。如倍系列稀释：、。分

6、别作和基因标准曲线。反应体系及条件见，仪器软件（公司产品）自动分析给出扩增效率（，（）。基因相对定量分析）实验数据分别采用（法及%软件分析（表基因表达相对定量分析以不同剂量）法计算为，）。如肺癌基因表达比值采用（）而采用%软件分析为，可见采用（法分析的诱导的、转化的及肺癌细胞为模板，进行实时定量，参见。每表达比值均比%软件分析高。表基因相对定量表达比值）法计算的表达比值均比"软件分较，表明采用（剂量（）表达比值（值）（析高。等指出若目的基因与参考基因的扩增效率相差超过，最好采用"软件分析。采用实时技术相对定量基因表达，关键一步就是标准曲线的制作，即获得标准曲线的斜率，计算扩

7、增效率。一般仪器说明书建议使用倍稀释法。本文分别采用了倍、倍及倍系列稀释制作和基因标准曲线，结果表明倍系列稀释呈现较好的线型关系（）。总之，实时技术与"软件分析相结合是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。参样本正常"次诱导（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）肺癌转化讨论采用实时技术进行基因表达分析包括绝对考文献定量及相对定量法。由于研究者多关注目的基因的表达变化，即实验组与对照组目的基因表达比值的变化。相对定量法已成为基因表达分析最常用的手段。目前市面上销售的荧光定量仪如公司、）公司等多采用的（相对定量法。因其将的扩增效俞顺章，陈声林我国分子流行病学研究进展中华流

8、行病学杂志，（）：，（），（）：张驰宇，徐顺高，黄新祥一种新颖简便的荧光实时率设定为，但实际的扩增效率不可能达到，因此该法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高。"软件（）是专门设计用于实时技术相对定量基因表达分析。其具有如下优势：扩增效率的修正，表达比值（相对定量方法的建立生物化学与生物物理进展，（）：江庆澜，李瑜元，曾峥，等盐酸二甲双胍对非酒精性脂肪肝大鼠脂肪组织肿瘤坏死因子基因表达的影响中山大学学报（医学科学版），（）：目的基因（样品均数对照均数，目的基因）（样品均数对照均数，）的计算包括了目的基因及参考基因的扩增效率，结果更准）确，并不一定要像（法要求目的基因及参考基因的扩，（）：增效率一致；统计学分析，采用简单的统计学随机检验（），克服了传