大豆硫转运蛋白基因GmSULTR12b启动子的克隆及活性分析_周小琼_图文

1、中国农业科学 2015,48(8:1650-1659Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.20大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析周小琼,丁一琼,左 丽,喻德跃(南京农业大学农学院/国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京 210095摘要:【目的】硫转运蛋白(sulfate transporter,SULTR参与根系对外界环境中硫酸根(SO42-的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO42-吸收转运到植物根系

2、中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的DNA为模板,进行普通PCR扩增,将克隆的启动子序列与GUS连接构建植物重组表达载体pSULTR1;2bGUS。利用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导的遗传转化法转化大豆进行瞬时表达,以GUS为报告基因对

3、启动子的活性进行分析。另外,将重组质粒转入发根农杆菌K599中进行大豆毛状根转化试验,借助于GUS报告基因,通过体视镜观察毛状根的横切面,分析启动子在根中的表达情况。最后以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS酶活试验(GUS activity分析启动子的活性。【结果】克隆大豆品种南农N2899的GmSULTR1;2b启动子与NCBI序列基本一致。通过在线预测分析启动子的调控元件发现该启动子具有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box外,还含有激素应答元件ERE(乙烯响应元件、ABRE(脱落酸响应元件等,胁迫应答元件TC-rich repeats(干旱胁迫以及病虫害胁迫、AT-rich ele

4、ment(AT-rich的DNA与蛋白结合位点和MYB等。重组载体pSULTR1;2bGUS经PCR和测序鉴定,证实已构建成功。大豆瞬时表达后进行X-gluc染色显示,重组载体侵染的大豆显蓝色,说明GmSULTR1;2b启动子能够驱动下游GUS的表达。对转化的毛状根染色之后,体视镜下观察阳性根的横切面,发现GUS主要在根毛、根表皮和中柱内表达,表明GmSULTR1;2b启动子主要在根毛、根表皮和中柱内表达。对转化毛状根进行GUS酶活试验(GUS activity说明该启动子的启动活性比CaMV35S启动子的启动活性弱。【结论】克隆了GmSULTR1;2b启动子序列,该启动子具有驱动下游GUS的

5、表达的功能,而且该启动子在根毛、根表皮和中柱内表达。关键词:大豆;GmSULTR1;2b;启动子;瞬时表达;GUS活性Cloning and Activity Analysis of the Promoter of SulfateTransporter Gene GmSULTR1;2bZHOU Xiao-qiong, DING Yi-qiong, ZUO Li, YU De-yue(College of Agronomy, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/National Key L

6、aboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095Abstract: 【Objective】Following the nitrogen, phosphorus and potassium, sulfur is the fourth nutrient necessary for the plants. Sulfur-containing organic compounds involved in many important physiological and biochemical reactions in

7、 plants, which play an important role in withstanding environmental stress and growth and development of plants. Sulfate transporters (sulfate transporter, SULTR participate in absorption and transportation of the exogenous sulfate(SO42-. The sulfate transporter gene GmSULTR1;2b of soybean is specif

8、ically expressed in the root, which plays a role in transporting sulfate from the environment.收稿日期:2014-09-19;接受日期:2014-12-29基金项目:国家“973”重点基础研究发展计划(2010CB125906联系方式:周小琼,Tel:150*;E-mail:2012101143。通信作者喻德跃,E-mail:dyyu8期周小琼等:大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析 1651Cloning the promoter of GmSULTR1;2b, and s

9、tudying on its activity and tissue expression will contribute to understanding theregulatory mechanism of GmSULTR1;2b. It can also provide a molecular foundation for improving the content of sulfur aminoacid in soybean.【Method】According to the sequence of GmSULTR1;2b in the NCBI, the predicted 2 259

10、 bp upstream wasanalyzed and predicted as the promoter. The online debases PLACE and Plant-CARE were used to prognose the regulatoryelements of the sequence. The sequence was obtained by PCR through taking the soybean cultivars Nannong N2899 DNA astemplate. The sequence was fused with GUS to constru

11、ct the plant expression vector pSULTR1;2b:GUS. The binary vectorconstructs were transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 by the freeze-thaw method. The transient expression assayswere carried out in soybean by Agrobacterium tumefaciens-mediated method, and the activity of the promoter was a

12、nalyzed byusing GUS as the reporter gene. In addition, hairy root transformation experiment was carried out by transforming the binaryvector constructs into Agrobacterium rhizogenes K599. By analyzing the transverse section of the hairy roots under thestereoscope, its expression was observed. Finall

13、y, the GUS activity was implemented to test the activity of the promoter, whichwas based on the positive transformed hairy roots.【Result】The cloned promoter sequence of GmSULTR1;2b from NannongN2899 was basically in line with the sequence in NCBI. Through online prediction analysis of regulatory ele

14、ments, it was foundthat the promoter contained not only TATA-box, which was the necessary component of eukaryote, but also contained hormoneresponse element ERE (ethylene response element, ABRE (abscisic acid response element, stress response element TC - richrepeats (diseases and insect pests stres

15、s and drought stress, the AT - rich element (the DNA of AT - rich and protein binding sitesand MYB, etc. The successful construction of the recombination vector pSULTR1;2b:GUS was confirmed via PCR andsequencing appraisal. The X-gluc dyeing conducted on the transient expression of soybean showed blu

16、e where the soybean wasinfected by the recombinant vector pSULTR1;2b:GUS. It indicated that the promoter could drive GUS expression downstream.After staining the transformed hairy roots, the transverse section of the positive hairy roots was analyzed under the stereoscope.The GUS was mainly found in

17、 the root hair, root epidermis and the stele, which manifested the promoter mainly expressed in theroot hair, root epidermis and the stele. The GUS activity test of the transformed hairy roots attested weaker activity than thepromoter of CaMV35S.【Conclusion】GmSULTR1;2b promoter was cloned. It could

18、drive GUS in the downstream, and express inthe root hairs, root epidermis and the column.Key words: soybean; GmSULTR1;2b; promoter; transient expression; GUS activity0 引言【研究意义】硫是植物继氮、磷、钾之后的第四个重要元素,对大豆(Glycine max(L. Merr.尤为重要1-2。大豆硫转运蛋白(sulfate transporter,SULTR家族负责吸收转运外界环境的SO42-。SO42-通过植物根系进入植物体内进行

19、还原同化作用,生成一系列重要化学物质3-5。启动子控制基因的表达,研究大豆硫转运蛋白基因的启动子对于了解该基因的调控机制有重要意义。【前人研究进展】编码硫转运蛋白基因最先由酵母菌的功能互补试验所鉴定,通过对酵母硫转运蛋白(SULTR缺失的突变体酵母菌株进行功能互补试验确定了该基因所编码的蛋白具有SO42-转运功能6-7。后来许多硫转运蛋白(SULTR在不同植物中克隆出来8-10。在植物中硫转运蛋白是由许多成员组成的硫转运蛋白家族,该家族在不同的植物中由1216个基因组成,根据功能差别将其分成不同的亚家族11。在拟南芥中,硫转运蛋白家族由14个基因组成,明显地分成5个不同的功能亚家族,但是研究表

20、明拟南芥第五亚家族的2个基因是钼转运蛋白12-14。通过对拟南芥突变体的分析确认了2个密切相关的硫转运蛋白SULTR1;1和SULTR1;2,能促使硫酸盐进入根,特别是在硫限制的情况下15-16。进一步研究证明二者主要在根毛、根表皮和皮层细胞内表达17-19。丁一琼等20克隆了大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b, GmSULTR1;2b与拟南芥ATSULTR1;2蛋白序列相似性为83%。通过酵母互补试验证明该基因可以互补sul1和sul2的缺陷,具有SO42-转运活性。通过半定量RT-PCR分析发现该基因在根中特异表达,能响应环境胁迫。所以GmSULTR1;2b很可能是负责从土壤中吸收S

21、O42-的高亲和性硫转运蛋白。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes侵染植物后,能够诱导植物产生分支的不定根,也称为发状根或毛状根21。培养毛状根可以用于生产植物次级代谢产物22-24,研究与根发育相关基因的研究25,也用于分析启动子的功能26。【本研究切入点】南京农业大学国家大豆改良中心先前对大豆硫转运蛋白家族进行了深入研究,对GmSULTR1;2b的功能进行初步验证,但未对该基因的启动子进行研究。【拟解决的关键问题】本研究利用普通PCR方法克隆GmSULTR1;2b上游启动子,1652 中国农业科学48卷分析启动子序列,并构建表达载体验证该启动子的活性,通过大豆毛状根

22、转化试验对启动子活性进行定量检测,有助于了解大豆GmSULTR1;2b的调控模式,也为今后相关转录因子的研究提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料大豆品种南农N2899,由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源库提供,播种于南京农业大学江浦试验基地,自然条件下生长。细菌材料:大肠杆菌(Escherichia coliDH5购于天根生化科技有限公司。根癌农杆菌菌株EHA105、发根农杆菌菌株K599由南京农业大学国家大豆改良中心保存。植物表达载体pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301由南京农业大学国家大豆改良中心保存。1.2 DNA的提取以及引物设计以大豆品种南农N2899为材料,在正

23、常生长季节将大豆种植于南京农业大学江浦试验基地,选取生长良好的幼嫩叶片,采用CTAB法提取叶片基因组DNA27。根据NCBI上比对获得的大豆硫转运蛋白基因(命名为GmSULTR1;2b,登录号Gene ID: 100806204转录起始位点(TSS上游和下游序列设计2对特异引物QDZ1-F/R和QDZ2-F/R用于扩增约2.3 kb的序列(表1。其中,上游引物在转录起始位点TSS上游2 190 bp,下游引物在TSS后69 bp。表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 Primer name 引物序列Primer sequence (5-3 扩增长

24、度PCR product length (bp 退火温度Annealing temperature ( QDZ1 F:AAATTGGCGGTCAACGGCTACGCTC 2259 63 R:GAAACCAAAAGGCCCAGTGAAAGTACCQDZ2 F:CGCCTTTGCGTATGGAGTGGAGTCTA 2178 62 R:GAAACCAAAAGGCCCAGTGAAAGTACC1.3 启动子的克隆及序列分析以大豆品种南农N2899的DNA为模板,用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo扩增启动子全长序列。将PCR 产物进行凝胶电泳检测,结果显示,条带大小与目的片段一致,用PCR回收试剂盒回

25、收纯化PCR产物,回收后产物与T载体重组,然后按照分析克隆28将重组载体转化大肠杆菌DH5。经菌液PCR鉴定为阳性的样品送到上海桑尼生物科技有限公司测序验证。测序正确的菌液提取质粒并命名为PTA2- pSULTR1;2b。测序结果用DNAMAN软件进行比对,比对正确的序列用植物顺式元件数据库PLACE(plant cis-acting regulatory DNA elements,www. Dna. Affrc. Go. jp /PLACE /29和数据库Plant-CARE(plant cis- acting regulatory element,http: /bioinformatics

26、. Psb. Ugent. be /webtools /plantcare /html/30在线预测分析启动子可能存在的顺式作用元件。1.4 构建植物表达载体以测序正确的质粒PTA2-pSULTR1;2b为模板,添加酶切位点(正向引物中添加Bam H酶切位点,反向引物中添加Nco酶切位点的特异引物(P2248F:5-ACGCGGATCCAACGGCTACGCTCTC CATTCAA-3,P2248R:5-CATGCCATGGAAACCA AAAGGCCCAGTG -3进行PCR扩增(下划线表示酶切位点。1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物和目的片段大小一致。将目的片段回收后与载体pCAMBIA13

27、81Z都用Bam H和Nco进行双酶切、连接、转化大肠杆菌DH5、提取质粒并用PCR验证。把阳性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司测序进一步验证启动子片段是否已经正确连接到载体pCAMBIA1381Z上。1.5 大豆瞬时表达、毛状根转化及启动子活性分析 1.5.1 根癌农杆菌介导的大豆瞬时表达 将测序正确的质粒命名为pSULTR1;2bGUS。通过冻融法31将融合载体pSULTR1;2bGUS以及载体pCAMBIA1301(阳性对照:CaMV35SGUS和pCAMBIA1381Z(阴性对照:无启动子分别转化至根癌农杆菌Agrobacterium菌株EHA105中。通过农杆菌介导大豆子叶节的方法进

28、行遗传转化32-33:挑取根癌农杆菌EHA105单克隆,接种在含卡那霉素(50 g·mL-1的液体YEB培养基中,220 r/min、28过夜培养。用分光光度计测OD600 =1.21.5。室温下, 4 000 r/min离心10 min,弃上清,用液体MS(含150 mmol·L-1乙酰丁香酮重悬浮菌体,至OD600 =0.28期周小琼等:大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析 16530.5。挑选无病、饱满的大豆种子平铺于90 mm的培养皿中,利用NaClO和浓HCl反应产生Cl2 对大豆种子进行灭菌,68 h后取出大豆种子,于超净工作台中吹2

29、h左右。将灭菌的种子接种于MS上,在25、光照16 h/黑暗8 h条件下培养34 d。用手术刀切下胚轴至5 cm左右(距离子叶节5 cm,去掉种皮,沿着子叶节下胚轴垂直剖开种子,并在子叶和子叶下胚轴连接处垂直于胚轴处制造伤口,同时在下胚轴处也制造伤口。将子叶加入到悬浮好的菌液中,于28, 100 120 r/min侵染30 min,然后吸干菌液转移到固体MS上,25、黑暗条件下培养34 d。1.5.2 发根农杆菌介导的大豆毛状根遗传转化 通过冻融法31将融合载体pSULTR1;2bGUS以及载体pCAMBIA1301(阳性对照分别转化至发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes

30、菌株K599中。大豆根毛的遗传转化方法34:挑取发根农杆菌K599单克隆,接种在含卡那霉素(50 g·mL-1的液体YEB培养基中, 220 r/min、28过夜培养。用分光光度计测OD6000.8。室温下,3 000 r/min离心10 min,弃上清,用10 mmol·L-1 MgCL2重悬浮,稀释至终浓度OD600为0.60.8备用。种子灭菌方法同上。将无菌大豆种子种在1/2 MS培养基中,在25、光照16 h/黑暗8 h条件下培养56 d。在超净工作台中去掉大豆种皮,用手术刀切下大豆子叶,用无菌刀在每个子叶背部挖一个小洞,把子叶转移到含头孢和羧苄霉素(250 g&#

31、183;mL-1的Whiter培养基上。将稀释好的菌液滴到洞里,于25暗培养1520 d。1.5.3 GUS染色及活性分析 参照Jefferson等35方法测定大豆组织中GUS报告基因的表达情况。将待染色的外植体浸泡在GUS染色液(50 mmol·L-1磷酸钠缓冲液pH 7.0、10 mol·L-1 EDTA、0.1% Triton X-100、1 mmol·L-1 /L K3Fe(CN6、1 mmol·L-1 K4Fe(CN6、1 mmol·L-1 X-Gluc中,置于37中保温过夜,用70%乙醇冲洗脱色,直至底色完全消失,在体视镜下拍照观察

32、结果。将需要测定GUS酶活的材料置研钵中加液氮研磨成粉末加入提取缓冲液(50 mmol·L-1 NaH2PO4 (pH7.0、10 mmol·L-1 EDTA、0.1% Triton X-100、0.1(w/v十二烷基磺酸钠、10 mmol·L-1-巯基乙醇, 4,12 000 r/min离心10 min,此时的上清即为GUS 蛋白提取液。用BSA法测定蛋白浓度。取出部分加GUS反应底物4-MUG,于37反应30 min,在激发光365 nm发射光455 nm的条件下进行荧光测定,3次生物重复,最终以单位时间内产物的相对变化量来计算GUS酶活性值。2 结果2.1

33、启动子的克隆与序列分析根据设计的引物进行PCR扩增,分别得到约2.3 kb的条带,测序结果显示,扩增序列与大豆基因组数据库的序列基本一致,该序列可以用于下步试验。把转录起始位点TSS(transcriptional start site的第一个碱基定义为+1,将克隆的2 259 bp的序列进行在线预测,结果(图1显示GmSULTR1;2b启动子不仅含有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box,还含有其他调控元件。(1激素应答元件:ERE(乙烯响应元件、ABRE(脱落酸响应元件、TCA-element(水杨酸响应元件、P-box(赤霉素响应元件。(2光响应元件:Box1、Box4、 G-Bo

34、x、ACE等。(3胁迫应答元件:TC-rich repeats(干旱胁迫以及病虫害胁迫、HSE(热胁迫等。(4结合位点:AT-rich element(AT-rich的DNA与蛋白结合位点、CCAAT-box(MYBHv1结合位点、 MBS(MYB结合位点以及MYB等。2.2 植物表达载体的构建将得到的启动子片段(2 259 bp双酶切并连接到载体pCAMBIA1381Z(只有GUS,没有启动子上后转化大肠杆菌。对重组质粒进行PCR鉴定,表明GmSULTR1;2b启动子已经插入到pCAMBIA1381Z中重组质粒(图2。2.3 根癌农杆菌介导的大豆瞬时表达及GUS染色将重组表达载体pSULTR

35、1;2bGUS、pCAMBIA1301以及pCAMBIA1381Z转入农杆菌EHA105中,其中, pCAMBIA1301载体为阳性对照(CaMV35SGUS, pCAMBIA1381Z载体为阴性对照(只有GUS,没有启动该基因的启动子。通过根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化进行瞬时表达。从图3中显示转入pCAMBIA1301载体(图3-A以及重组载体pSULTR1; 2bGUS(图3-B的农杆菌侵染大豆后均能检测到GUS的表达产物,说明克隆的GmSULTR1;2b启动子能够驱动下游基因GUS的表达,也就是说该启动子片段具有驱动活性。但是目的载体GUS染色没有阳性对照(CaMV35S启动子染色

36、深,说明其活性比CaMV35S启动子的活性低。pCAMBIA1381Z载体没有启动子驱动GUS的表达,所以检测不到GUS表达(图3-C。1654 中国农业科学48卷 图1 GmSULTR1;2b启动子的序列分析Fig. 1 Nucleotide sequence analysis of GmSULTR1;2bpSULTR1;2b GUSpSULTR1;2b promoterBam H Nco (0Ahd1GUSGUSCaMV 35SHygCaMV 5UTRNOS 3UTR Pml1Sph1Psi1KanTB T-DNA repeatRB T-DNA repeatbom site11226 bp

37、SgrA1Bsa1Acl1图2 重组质粒pSULTR1;2b GUS 图谱Fig. 2 The carrier structure of recombinant plasmid of pSULTR1;2b GUS A :pSULTR1;2b GUS 瞬时表达;B :CaMV35S GUS 瞬时表达;C :阴性对照A: Transient expression of pSULTR1;2b GUS; B: Transient expression of CaMV35S GUS; C: CK图3 大豆子叶节瞬时表达结果Fig. 3 Results of transient expression in

38、 soybean cotyledon section2.4 发根农杆菌介导的大豆毛状根遗传转化以及GUS 活性分析大豆的GmSULTR1;2b 与拟南芥的ATSULTR1;2同源性很高,蛋白序列相似性为83%20。ATSULTR1;2的启动子能够驱动下游GFP 在根毛、根表皮、根的皮层细胞以及叶片的保卫细胞中表达19。丁一琼等20研究发现大豆GmSULTR1;2b 也在根中特异表达。为了验证GmSULTR1;2b 启动子在根中的稳定表达情况,进行大豆毛状根稳定转化体系进行验证。载体pSULTR1;2b GUS 及pCAMBIA1301通过发根农杆菌K599介导,稳定转化大豆。将新长出的8 cm

39、左右的毛状根取出,进行GUS染色,进一步定性检测GmSULTR1;2b启动子的活性以及其在根毛中的表达情况。测定GUS酶活,定量判断GmSULTR1;2b 启动子的表达。对转基因根毛组织染色结果如图4(A、C,表明GmSULTR1;2b启动子和CaMV35S启动子都能在转基因大豆根毛中驱动报告基因的表达,但是GmSULTR1;2b启动子的活性比CaMV35S启动子的活性低,这和上面结果(图3一致。为了定量检测GmSULTR1;2b启动子和CaMV35S启动子的活性,进行了GUS酶活测定试验(图5。从图5可以看出GmSULTR1;2b启动子的活性比CaMV35S启动子的低,这和上面结果一致。为了

40、解GmSULTR1;2b启动子在根组织中的表达情况,观察染色后根毛的横切面。从图4(B、D中可看出GUS在根毛、根表皮、根的皮层细胞和中柱中有表达,这和拟南芥ATSULTR1;2启动子的表达情况类似18-19。 A、C:分别是pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS转化大豆毛状根后GUS染色;B、D:分别是pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS转化大豆根毛后的根横切面A,C: GUS staining of pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS in transgenic soybean root hair, respectively; B,D: The GUS

41、staining of root transverse section of pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS in transgenic soybean root hair, respectively图4 大豆根毛转化的GUS染色Fig. 4 Histochemical analysis of GUS staining in transgenic soybean root hair GUS酶活(单位:UGUSactivity(Units A、B表示显著性差异(P<0.001A, B indicate significant difference (P<0.001图

42、5 大豆毛状根转化的GUS酶活分析Fig. 5 Enzymatic assay of GUS activity in transgenic soybeanhairy roots3 讨论拟南芥的2个高亲和硫转运蛋白SULTR1;1和SULTR1;2同源性为72.6%,负责把SO42-从土壤中吸收到根部15-16,19。虽然存在一定的冗余功能和表达模式,但是SULTR1;2仍然是负责硫吸收以及转运的主要组成部分15,19。最近研究表明ATSULTR1;2可能在感应硫浓度机制中参与调控作用36。SULTR1;1由于Km值更低,能特异吸收环境中微量的SO42-,缺硫时受到强烈诱导16,19。SULTR

43、1;3在韧皮部表达,且负责硫从源到库的再分配37。SO42-进入植物根之后,SULTR2;1主要负责把硫从根转运到茎38-40。第3亚家族以及第4亚家族SULTR3和SULTR4的基因负责把SO42-进一步转运到叶绿体40-41以及胞质42中。拟南芥中硫转运蛋白家族基因之间相互协调共同把SO42-从外界环境吸收进入植物体内并转运到相应组织中进一步进行同化代谢。GmSULTR1;2b为SULTR第1亚家族的基因,具有硫转运活性,在根中特异表达,且能够响应低硫胁迫20。高等植物基因的表达受到复杂的调控,但是主要发生在转录水平上,受多种顺式作用元件与反式作用因子的相互协调作用。启动子是转录水平调控中

44、重要的顺式作用元件,是转录调控的中心,在一定程度上决定了目的基因表达的时间和空间顺序。因此,在植物遗传工程研究中,对启动子的结构、功能进行研究是了解植物基因表达调控分子机理的关键,也是开展植物基因工程研究首要解决的问题。已经通过研究拟南芥硫转运蛋白基因的启动子,表明基因的主要表达部位18-19,Chai等43通过5端和3端删除分析找到一个核心启动子区域,并对该区域进行人工组合,且该合成的启动子能够受到疫霉(Phytophthora sojae的诱导,可以用于植物抗病新品种的培育。大豆中氨基酸含量不均衡,含硫氨基酸含量很低,限制了其营养品质。期望通过基因工程方法调节硫代谢途径的SO42-流的分布

45、,为提高含硫氨基酸含量提供依据。本研究从大豆基因组中克隆了GmSULTR1;2b启动子片段。通过序列分析表明该启动子具有除了具有TAAT-box外,还具有激素应答元件ABRE、胁迫应答元件以及MYB等。研究GmSULTR1;2b时发现该基因在0.2 mol·L-1甘露醇处理模拟干旱处理下,过表达GmSULTR1;2b转基因烟草的鲜重、根长以及侧根数都要比对照显著提高。而在0.4 mol·L-1甘露醇处理下对照与转基因烟草的鲜重、根长与侧根数没有显著性的差异20。由此可见,过表达GmSULTR1;2b能在一定程度上提高烟草植株的抗逆能力。这可能和启动子的结构有一定的关系,但这

46、一结论还需要更多的试验数据支撑。这些顺式作用元件的预测可以为酵母单杂交试验提供一个理论依据,也为该基因调控模式的研究提供一个理论基础。通过研究AtSULTR1;1启动子5区域表明存在植物激素响应因子,对转基因拟南芥AtSULTR1;1启动子片段5和3端删除分析,鉴定到一个位于ATSULTR1;1启动子-2 777-2 762 bp处能够响应低硫的顺式作用元件SURE(sulfur-responsive element44。但是SURE存在于ATSULTR1;1启动子中,ATSULTR1;2中不存在44,同样在GmSULTR1;2b 启动子序列中也没有发现SURE顺式作用元件,说明了这些硫转运蛋

47、白调控的多样化。事实上,ATSULTR1;1更明确地被硫限制所控制。然而,ATSULTR1;2似乎由普通的代谢需求和细胞的状态所调节45。本研究确定了GmSULTR1;2b启动子的活性以及在根中的表达情况。该启动子很有可能在大豆根中特异表达。GmSULTR1;2b在低硫环境中其表达量增加20,暗示GmSULTR1;2b启动子的活性在低硫条件下其活性可能会增强。可以分离出该启动子片段,并找出其响应低硫的核心片段,人工组建启动子,应用于分子育种。这样不仅能够使基因在特定组织表达,还能在低硫条件下提高作物(尤其是大豆对硫的吸收,增加作物硫的含量。4 结论克隆了大豆GmSULTR1;2b上游2 259

48、 bp的启动子片段,并构建了植物表达载体pSULTR1;2bGUS。通过大豆瞬时表达证明该启动子能够驱动其下游GUS的表达,GmSULTR1;2b启动子主要在根毛、根表皮以及中柱中表达。References1 陆景陵. 植物营养学(上册: 第二版. 北京: 中国农业大学出版社,1994: 133-136.Lu J L. Plant Nutrition (Volume: The Second Edition. Beijing: The Agricultural University Press of China, 1994: 133-136. (in Chinese 2 Hari B K. En

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