恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因复合核酸疫苗诱导小鼠抗体免疫性的研究

1、    恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因 复合核酸疫苗诱导小鼠抗体免疫性的研究        摘要：目的检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因为基础的复合核酸疫苗(分泌性的VR1012/TPA/HG-MSP1-17和非分泌性的VR1012/HG-MSP1-17)诱导小鼠的体液免疫反应和免疫血清对疟原虫生长的抑制能力。 方法以200g/100l或100g/100l每次每只VR1012/HG-MSP1-17或VR1012/TPA/HG-MSP1-17

2、肌注免疫BALB/c或C57BL/6小鼠。用ELISA间接法测定小鼠血清的特异性抗体，用体外抑制试验检测免疫血清抑制疟原虫生长效果。 结果经3次100g/100l每次每只VR1012/HG-MSP1-17免疫后，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均产生了明显的HG和YMSP119抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经3次200g/100l每次每只的VR1012/HG-MSP1-17免疫后，产生了较高的HG抗体，但MSP1-17的抗体无明显变化，经3次200g/100l每次每只VR1012/TPA/HG-MSP1-17免疫后，仅产生较低的HG抗体，无MSP1-17抗体的产生。用200g/

3、100l VR1012/HG-MSP1-17免疫的BALB/c小鼠血清做体外抑制试验，结果抑制效果明显。 结论VR1012/HG-MSP1-17比VR1012/TPA/HG-MSP-17具有更强的免疫原性，其免疫鼠血清能明显地抑制疟原虫生长。关键词：恶性疟原虫； 核酸疫苗； 裂殖子表面蛋白1； T细胞表位Humoral immune response to Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 C-terminal region based hybrid nucleic acid vaccines in miceMIAO JunLI

4、 XunXUE Caifang, et al（Department of Parasitology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, P.R.China）Abstract：ObjectiveTo analyze humoral immune response to nucleic acid vaccines (VR1012/TPA/HG-MSP1-17 for intracellular expression or VR1012/HG-MSP1-17 for secretion) which contain Plasm

5、odium falciparum Merozoite surface protein 1(MSP1) 17 block gene and gene fragment of several T cell epitopes from MSA1, MSA2, RESA, IL-1 and TT and to monitor the effect of DNA-immune sera on parasite inhibition. MethodsBALB/c or C57BL/6 mice received three intramuscular immunizations with 200g/100

6、l or 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 or VR1012/TPA/HG-MSP1-17 per mouse each time. HG or MSP1-17 antibodies were monitored by indirect ELISA. The effect of immune sera on parasite inhibition was monitored by in vitro inhibition assays. ResultsBALB/c and C57BL/6 mice immunized with 100g/100l of VR1012

7、/HG-MSP1-17 per mouse gave significantly HG and MSP1-17 antibodies, but the levels of antibodies were not high. BALB/c mice immunized with 200g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 per mouse gave higher HG antibodies but no change in MSP1-17 antibodies. BALB/c immunized with 200g/100l of VR1012/TPA/HG-MSP1-17

8、per mouse gave low level of HG antibodies and no MSP1-17 antibodies. Sera from the mice immunized with 200g/100l VR1012/HG-MSP1-17 could significantly inhibit Plasmodium falciparum growth. ConclusionVR1012/HG-MSP1-17 is more immunogenic than VR1012/TPA/HG-MSP1-17. The sera of VR1012/HG-MSP1-17 immun

9、ized mice could inhibit parasite growth prominently.Key words：Plasmodium falciparum; Nucleic acid vaccine; Merozoite surface protein 1; T cell epitope疟疾控制正处在疟原虫抗药性和蚊媒药性的不断扩展的困境下，使得研制有效的抗疟疫苗成为当前的迫切需要。而近几年发展的核酸疫苗开辟了一个研制疫苗的新途径，核酸疫苗具有明显的优势，其能引起明显的细胞免疫反应；体内为真核天然表达，不需体外表达、纯化等繁琐工作；以及制备、携带方便、廉价等优点。其在多种病毒和细菌

10、等感染性疾病的研究中取得可喜结果1。Hoffman等2构建了包含疟原虫子孢子蛋白基因片段的核酸疫苗，经免疫小鼠后产生了明显的保护性免疫。WHO/TDR资助我室进行红内期核酸疫苗的研究。本文报道在成功构建了编码恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原MSP1的羧基端片段（即17区）和若干个T细胞刺激表位的复合核酸疫苗的基础上3，研究该核酸疫苗在小鼠体内诱导的体液免疫反应，并观察免疫血清在体外抑制疟原虫生长的能力。材料和方法质粒、菌株及疟原虫株：VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17、VR1012和VR1012/TPA。VR1012由美国Hoffman SL博士惠

11、赠，为含巨细胞病毒早期启动子和多聚A尾的非分泌型真核表达载体，将信号肽基因TPA插入VR1012的多克隆位点前使其改建为分泌型真核表达载体VR1012/TPA。HG基因为编码MSA1、MSA2、RESA内的T细胞位点和外源IL-1、TT的广谱T细胞刺激位点的杂合基因片段，MSP1-17为编码MSP1羧基端17区片段基因。VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17的构建见文献3。菌株为JM109菌。培养的疟原虫为恶性疟原虫FCC1/HN株。动物：由第四军医大学动物中心提供。46周龄雌性BALB/c和C57BL/6小鼠分为VR1012/HG-MSP1-17免疫组

12、或VR1012/TPA/HG-MSP1-17免疫组，VR1012或VR1012/TPA对照组，每组5只。其它：LB培养基为Sigma公司产品，BL20A全自动高速冷冻离心机(湘西仪器仪表总厂)，质粒纯化试剂盒QIAGEN tip-500纯化柱为德国QIAGEN公司产品。质粒纯化：将VR1012/HG-MSP1-17、VR1012/TPA/HG-MSP1-17、VR1012和VR1012/TPA分别转化新鲜制备的感受态JM109菌，大量摇菌，按QIAGEN tip-500纯化柱操作指南大量纯化上述质粒，纯化质粒的纯度达A260A280>1.80。免疫方法： 将纯化质粒用75%酒精洗泡消毒后

13、，溶于0.01mol/L pH7.4的PBS中，配成终浓度200g/100l和100g/100l。小鼠在每次免疫前用1%戊巴比妥纳按75mg/kg体重腹腔注射麻醉，待小鼠肌肉松弛后，将质粒注射入小鼠的两侧胫前肌和两侧股四头肌内，每点25l，每只小鼠每次免疫共注射100l。小鼠分别在0、3、6周进行3次免疫。抗体检测：小鼠分别于免疫前1周和第3次免疫后2周以玻璃毛细管在尾静脉取血，分离出血清。用间接ELISA法测定抗MSP1-17的抗体，具体参照Chang SP4的方法。用BBS（167mmol/L硼酸，134mmol/L NaCl, pH8.0）将真菌表达MSP1-17区蛋白（编码相对分子质量

14、为19×103蛋白，简称YMSP1195，由美国Kaslow DC博士惠赠）稀释成0.2g/ml，HG蛋白（为纯化的HG基因原核表达产物6）稀释成1g/ml，每孔50l包被ELISA板，室温2h后，用BBS洗板3次，每次1min，再用含1% BSA的BBS封闭1h，用含0.5mol/L NaCl的BBS（HSBBS）洗板3次，加入50l用1% BSA/BBS 150稀释的小鼠血清，室温1h后，用HSBBS洗板7次，加入50l 110000稀释度的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，室温1h后，用HSBBS洗板7次后BBS洗板1次，加入100l TMB底物溶液，用DG3022酶联仪读取波

15、长为450nm的吸光度(A)值。疟原虫体外抑制试验：于200g/100l VR1012/HG-MSP1-17第3次免疫BALB/c小鼠后2周，摘除眼球取血，分离血清用于疟原虫体外抑制试验。海南株(FCC1/HN)恶性疟原虫用人“O”型RBC和在含10%AB型血清的RPMI 1640中，37，5% CO2培养箱内培养。用5%山梨醇溶液进行两次同步化处理（间隔40h），第2次同步化后30h将疟原虫稀释成0.5%感染率。加入96孔培养板内，每孔200l，再加入20l（原液和110稀释）被试血清，于加入血清后24h和48h分别半量换液1次，在24h和72h，分别涂片，吉氏染色，镜下计数5000个RBC

16、，计算感染率，每个被试血清设3个复孔，同时设VR1012免疫血清对照，按下式计算原虫生长的抑制率：统计学方法：用t检验比较两均数间差异。结果BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分别经100g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫后，均产生了明显的抗HG和抗MSP1-17的抗体（表1和表2）。但抗体水平均较低。为提高体液免疫反应，BALB/c小鼠经200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫后产生了较100g/100l略高的HG抗体(P<0.05)，其抗体水平最高达A值1.00，最低达0.130（故其标准差较大，与免疫前相比P值只能达到<0.05），

17、但抗MSP1-17的抗体无明显提高。为比较分泌性与非分泌性核酸疫苗诱导的小鼠体液免疫反应的强弱，另一组BALB/c小鼠用同样剂量即200g/100l的VR1012/TPA/HG-MSP1-17进行免疫，3次免疫后小鼠产生了较弱的抗HG抗体(P<0.05)，没有产生抗MSP1-17的抗体（表3）。用200g/100l VR1012/HG-MSP1-17免疫的BALB/c小鼠血清进行疟原虫体外抑制试验。结果，血清明显抑制疟原虫的生长（表4）。涂片观察有大量的异常原虫，表现为：胞浆着色浅淡，胞核凝聚、分散，虫体皱缩等。VR1012免疫对照组血清无异常原虫发现。表1经100g/100l的VR10

18、12/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的HG和YMSP119抗体水平Table 1. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of BALB/c mice after immunigation for 3 times with 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-1 per mouse each timeAntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.062±0.0230.203±0.046<0

19、.01VR10120.056±0.0320.074±0.021>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-170.060±0.0200.175±0.097<0.05VR10120.071±0.0330.058±0.027>0.05表2经100g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫的C57BL/6小鼠的HG和YMSP119抗体水平Table 2. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of C57BL/6 mice after immuniza

20、tion for 3 times with 100g/100l of VR1012/HG-MSP1-17 per mouse each timeAntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.072±0.0220.228±0.055<0.01VR10120.064±0.0230.067±0.033>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-170.063±0.0180.154±0.054<0.

21、01VR10120.051±0.0340.065±0.023>0.05表3经200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17或VR1012/TPA/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的HG和YMSP119抗体水平Table 3. HG and MSP1-17 antibodies in the sera of BALB/c mice after immunization for 3 times with 200g/100l of VR1012/HG-MSP1-1 or VR1012/TPA/HG-MSP1-17 per mouse each time

22、AntibodyGroupBefore immunizationAfter immunizationPAnti-HGVR1012/HG-MSP1-170.063±0.0230.564±0.346<0.05VR10120.074±0.0350.066±0.043>0.05VR1012/TPA/HG-MSP1-170.047±0.0210.125±0.049<0.05VR1012/TPA0.031±0.0410.043±0.028>0.05Anti-MSP1-17VR1012/HG-MSP1-1

23、70.058±0.0170.156±0.061<0.01VR10120.053±0.0280.065±0.027>0.05VR1012/TPA/HG-MSP1-170.027±0.0210.045±0.031>0.05VR1012/TPA0.044±0.0370.054±0.027>0.05讨论以上结果表明，VR1012/HG-MSP1-17经肌注免疫后可以诱导BALB/c小鼠的HG和MSP1-17抗体的产生。BALB/c小鼠经200g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫与

24、100g/100l三次免疫产生的HG抗体比较，有明显升高，表明该抗体反应有剂量依赖性；但抗MSP1-17的抗体无明显变化，其原因不明。从总体来看，HG抗体较MSP1-17抗体高。有2只小鼠HG抗体表达A值为1.00，这可能是由于HG主要含有几个T细胞表位，特别是含有来自IL-1和TT的广谱T细胞刺激表位，有利于刺激TH细胞活化，进而促进抗体的产生。而对于HG的T细胞表位是否可以促进MSP1-17抗体的产生，还有待于进一步的研究。从免疫结果看，在同一组小鼠中有的抗体较高（0.50或0.10），有的小鼠抗体却不高（0.130），这可能是由于肌注免疫小鼠的操作不易，致使肌注不确切的结果7。表4经20

25、0g/100l的VR1012/HG-MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的血清对恶性疟原虫FCC1/HN株体外生长抑制结果Table 4. Inhibition of P.f(FCC1/HN) growth by the sera of BALB/c mice after immunization for 3 times with 200g/100l VR1012/HG-MSP1-17DilutionInhibition rate (%)24h72h1137.6±8.455.41±0.511023.4±5.535.7±7.8VR1012/TPA/HG

26、-MSP1-17仅在200g/100l免疫条件下产生较低的HG抗体，没有诱导出MSP1-17的抗体，表明非分泌性的VR1012/HG-MSP1-17较分泌性的VR1012/TPA/HG-MSP1-17具有较强的免疫原性。据报道，有的分泌性核酸疫苗和非分泌性核酸疫苗能诱导出相似的免疫反应8；而有的分泌性核酸疫苗则比非分泌性核酸疫苗诱导的免疫反应强9，可见不同的抗原在核酸疫苗条件下表现不一，其中的原因还不甚明了。据文献报道，针对MSP1 17区蛋白的数个单克隆抗体可明显的抑制裂殖子入侵红细胞10；原核表达的约氏疟原虫MSP1 C端17区片段蛋白可诱导小鼠产生完全抵抗鼠疟攻击的保护性免疫11，可见该

27、区表达蛋白是重要的疫苗候选抗原。原核表达的HG蛋白具有明显的免疫原性和明显的体外抑制疟原虫生长的能力6。本研究的VR1012/HG-MSP1-17诱导小鼠产生了较强的抗HG和抗MSP1-17的抗体，其能明显地抑制疟原虫生长，表明该构型的DNA免疫在保护性方面有一定效果。当然，其是否具有保护性尚需猴体试验进一步验证。同时，仍需通过共免疫细胞因子基因或改变HG辅助MSP1-17基因的方式，进一步增强HG和MSP1-17的免疫原性，从而获得更有效的DNA疫苗。核酸疫苗的真核表达特点保证了MSP1 17区内的双硫键的形成，而双硫键的形成是确保两个生长因子样结构形成的关键12。故核酸疫苗对于发挥MSP1

28、 17区的作用是十分有利的。核酸疫苗具有不需象其它基因工程疫苗那样的体外表达、纯化等繁琐工作的优势，又具有可诱导疟疾红内期免疫十分重要的细胞免疫的优点，故核酸疫苗用于疟疾具有很大的潜力。该研究对于研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。 基金项目：联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织热带病研究和培训特别规划署（TDR）资助项目(ID No.950385)作者单位：缪军（第四军医大学寄生虫学教研室）李（第四军医大学寄生虫学教研室）薛采芳（第四军医大学寄生虫学教研室）刘忠湘（第四军医大学寄生虫学教研室）甄荣芬（第四军医大学寄生虫学教研室）秦恩强（第四军医大学寄生虫学教研室）参考文献

29、：1Waine G, Mcmanus DP. Nucleic acids: vaccines of the future. Parasitology Today, 1995, 11(3): 113-116.2Sedegah M, Hedstrom R, Hobart P, et al. Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:9866-9870.3缪军，薛采芳，喻启桂，等. 以恶性

30、疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因为基础构建的复合核酸疫苗候选质粒. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1997, 15(6):321-325.4Chang SP, George SNH, Kato A, et al. Generalized immunological recognition of the major merozoite surface antigen (gp195) of Plasmodium falciparum.Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:6343-6350.5Kaslow DC, Hui GSH, Kumer S. Express

31、ion and antigenicity of Plasmodium falciparum major merozoite surface protein (MSP119) variants secreted from Saccharomyces cerevisiae. Mol Biochem Parasitol, 1994, 63:283-289.6Li Quanzhen, Li Yingjie, Xie Yi, et al. The development of a recombinant hybrid protein of Plasmodium falciparum and analysis of antigenicity and protectivity. J Med Coll PLA, 1994, 9(3):161-1677Inchauspe G, Vitvitski L, Major ME, et al. Plasmid DNA expressing a secreted or a nonsecreted form of hepatitis C virus nucleocapsid: comparative studies of antibodies and T-helper responses following genetic immunization.