携带RU486可调控式β-内啡肽腺病毒的构建及体外验证

1、携带RU486可调控式-内啡肽腺病毒的构建及体外验证上海交通大学医学院附属瑞金医院麻醉科宋小星 工作单位：200025 上海市，上海交通大学医学院附属瑞金医院麻醉科基金：国家自然科学基金资助 项目批号：30500479 尤圣武 彭章龙 于布为【摘要】 目的 构建携带RU486可调控小鼠神经生长因子前导肽与-EP的融合基因（NEP）的第一代复制缺陷型腺病毒。 方法 利用分子生物学方法构建由RU486可调控NEP基因的腺病毒穿梭质粒pDC312-RUNEP，利用AdMAXTM 系统重组得到第一代腺病毒Ad-RUNEP，进行扩增、纯化和滴度测定；同时分别构建携带报告基因RFP或 LUC的质粒pDC3

2、12-RURED与pDC312-RULUC。两个报告基因质粒分别转染HEK293细胞，通过定性和定量手段在载体水平检测RU486调控系统的功能；腺病毒Ad-RUNEP感染A431细胞株后第二天分别加入0、10-10、10-9、10-8 、10-7和10-6mol/l的RU486诱导，两天后更换培养液去除RU486， ELISA定量检测加入RU486之后第1、2和4天每一样本培养上清中-内啡肽的浓度，从而在病毒水平检测RU486调控系统的功能。 结果 Ad-RUNEP的滴度为2.25×1010pfu/ml；RFP和LUC的表达都随RU486呈剂量依赖性增加；第一代腺病毒Ad-RUNEP

3、中-内啡肽在给予RU486后开始表达（p<0.05），当RU486剂量达10-7mol/l时达到最大，当RU486给药停止后，-内啡肽的表达也随之减弱（p<0.05）。 结论 首次成功构建携带RU486可调控式-内啡肽的第一代复制缺陷型腺病毒Ad-RUNEP，RU486可以诱导调控Ad-RUNEP中-内啡肽的表达。【关键词】 RU486；调控；-内啡肽；腺病毒；构建；体外验证Construction and identification in vitro of the adenovirus carrying -endorphin regulated by the mifeprist

4、one-inducible system Song xiao-xing, YOU Sheng- wu, Peng zhang-long, YU Bu- weil. Department of Anesthesiology, ruijin Hospital, Shanghai jiaotong University, Shanghai 200025，China【Abstract】 Objective To construct and identify in vitro the adenovirus carrying -endorphin regulated by the mifepristone

5、-inducible system. Methods To construct the adenovirus shuttle plasmid pDC312-RUNEP carrying -endorphin regulated by the mifepristone-inducible system, pDC312-RURED encoding report gene RFP and pDC312-RULUC encoding report gene LUC by molecular biology methods. To recombinate first generation adenov

6、irus Ad-RUNEP by AdMAXTM system and amplify, purify and check the adenovirus vector. To check the regulating function of RU486 by expressing report genes RFP and LUC responding to different dosage of RU486, after pDC312-RURED or pDC312-RULUC was transfected. After 1 day infected with adenovirus Ad-R

7、UNEP, A431 were induced with different dose of RU486 (0、10-10、10-9、10-8 、10-7 or 10-6mol/l) for 48 hours to produce -EP. The doses of -EP in the mediums were measured by ELISA at 1, 2 and 4 days after induce stopping. Results Titer of Ad-RUNEP is 2.25×1010 Pfu/ml. RU486 induces report genes RFP

8、 and LUC expression in a dose-dependent manner. When the dose of RU486 arrived to 10-7mol/l, the expression of -EP increased to max. Moreover, elimination of RU486 results in shutting off -EP expression. Conclusion The first generation adenovirus encoding -endorphin regulated by RU486 (Ad-RUNEP) has

9、 been constructed successfully. RU486 can induce -EP expression to increase. 【Key words】RU486; Regulate; Beta -endorphin; Adenovirus; construction; identification in vitro-内啡肽（-EP）是一种重要的强效镇痛神经肽，前期研究1,2已经证实椎管内单次注射携带小鼠神经生长因子前导肽与-EP的融合基因（NEP）的第一代复制缺陷型腺病毒能够有效减轻神经病理性疼痛，其时效可达一个月左右。然而上述病毒目的基因为持续性表达，目前尚无法控制

10、其表达量，并且这种表达属非生理性分泌，所以它有可能干扰机体内分泌的调节，甚至持续表达产生的目的基因蓄积还可能会带来毒副作用3。因此在这些病毒内需要加入一种基因开关对其进行调控，以保证他们的安全使用。RU486调控系统是目前较为常用的基因开关。它的调控子由很少量RU486即可特异激活，而不会影响内源性孕酮受体的功能，并且这种调控系统非常适用于中枢神经系统的基因治疗4。因此，本研究拟采用RU486调控系统来控制NEP的表达，即在原有携带NEP融合基因的第一代腺病毒基础上，构建携带RU486可调控NEP基因的第一代复制缺陷型腺病毒，并通过控制RU486的给药剂量，观察-内啡肽在体外的表达是否与RU4

11、86具有量效关系，从而为今后慢性疼痛的病毒基因治疗中更好地控制转基因表达提供理论基础。材料和方法主要材料和试剂 pUC19-NEP（含人-内啡肽融合基因）、pDSred（含RFP报告基因的克隆载体）与pGL3-LUC（含LUC报告基因的克隆载体）均由上海东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室提供，pRS17(含RU486调控系统的克隆载体)由中科院刘新垣院士惠赠，5型腺病毒骨架质粒pBHGLoxPE1/E3Cre（加拿大MicrobixBiosystem公司）。LIPOFECTAMINE2000脂质体转染试剂盒（QIAgen公司，美国），PCR引物Vt01、Vt02、Vt03、Vt04、Vt05及

12、Vt06的合成与基因测序工作均由上海英俊生物技术有限公司完成。beta-Endorphin ELISA试剂盒（上海迪奥生物技术有限公司），Dual-Luciferase®报告基因检测试剂盒（Promega公司），人胚胎肾(HEK)293细胞(加拿大MicrobixBiosystems公司)，人皮肤癌扁平上皮（A431）细胞株（美国ATCC公司）。野毒检测引物Vt001和Vt002以及其它试剂材料由东方肝胆外科医院肿瘤病毒基因治疗实验室提供。引物序列 腺病毒E1b区上游引物（Vt001）5'-CTGGCCAATACCAACCTTA-3'和腺病毒E1b区下游引物（Vt00

13、2）5'-ATATGAGCTCACAATGCTTC-3'。BGHpolyA上游引物5'-ACGCGTCGACTACGAATTCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC-3'（Vt01）和下游引物5'-GGGGTACCATGACCGGTAAGCCATAGAGCCCACCGCAT-3'（Vt02）。NEP上游引物5'-TCGAGCTCGCTAGCACTAGTTTATCACTCGCCCTTCTTGTA-3'（Vt03）和下游引物5'-GGGTACCGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG-3'

14、（Vt04）。穿梭质粒构建 利用Vt01和Vt02扩增pRS17中的BGHpolyA，使其上游引入SacI、NheI和SalI酶切位点，下游引入AgeI、XbaI、KpnI酶切位点，将PCR产物KpnI和SacI双酶切后插入pBluescript的相应酶切位点，测序正确后命名为pBlue-BGH。pClon9-IC经AgeI和XbaI双酶切下INS-HCMV，后者插入pBlue-BGH的相应酶切位点中，构建成pBlue-BIC。应用NEP引物Vt03和Vt04扩增pUC19-NEP中NEP，在基因上下游分别引入NheI和SalI酶切位点，将该PCR产物经NheI和SalI双酶切插入pBlue-

15、BIC，测序正确者命名为pBlue-NBIC。由pBlue-NBIC经NheI和KpnI双酶切下NBIC片段，插入pRS17相应酶切位点中构建得到pRS17-RUNEP。pRS17-RUNEP再经NotI单酶切下RUNEP插入pDC312相应酶切位点中，构建成穿梭质粒pDC312-RUNEP。相同方法构建携带报告基因RFP与LUC的穿梭质粒pDC312-RURED与pDC312-RULUC。病毒包装 利用AdMAXTM 系统，将pDC312-RUNEP与腺病毒骨架质粒pBGLoxPE1/E3Cre共转染293细胞，通过细胞内同源重组获得RU486可调控式-EP的第一代非增殖型重组腺病毒Ad-R

16、UNEP。阳性病毒克隆的鉴定 用NEP引物Vt03与Vt04进行PCR鉴定阳性病毒克隆，再用腺病毒E1b区引物Vt001与Vt002鉴定是否含有野毒。纯化和滴度测定 取正确克隆病毒株经293细胞内扩增后收集病毒，用氯化铯密度梯度超速离心纯化后，取少量用50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度。载体水平验证 Lipofectamine2000脂质体转染法将pDC312-RURED与pDC312-RULUC分别转染铺有HEK293细胞的六孔板。转染24hr后，分别给予不同剂量的RU486进行诱导表达，所得浓度分别为0、10-6、10-7、10-8、10-9、和10-10mol/l，继续

17、孵育48hr后，pDC312-RURED板在荧光显微镜下观察，pDC312-RULUC板同时进行LUC阴性和阳性对照转染，采用Dual-Luciferase®报告基因检测试剂盒进行检测。病毒水平验证 观察不同剂量RU486诱导Ad-RUNEP在A431细胞中的表达以及撤药后表达的改变。按照MOI50，Ad-RUNEP感染铺有A431细胞的六孔板24hr后，加入不同剂量的RU486进行诱导表达，所得浓度分别为0、10-6、10-7、10-8、10-9、和10-10mol/l，继续孵育48hr后，去除原有细胞上清，换无RU486的培养上清继续孵育48hr。采样点选择以RU486加入后天数

18、计算，取第1、2、4天培养上清进行ELISA检测。统计分析 采用SPSS11.5统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，同组前后比较采用连续观察资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。结果病毒的鉴定 以Vt01和Vt02为引物PCR扩增片段为NEP，长度是498bp，见图1。以Vt001和Vt002为引物，扩增片段长度为880bp,见图2。病毒滴度测定 TCID50方法测定病毒Ad-RUNEP滴度为2.25×1010pfu/ml。红色荧光蛋白RFP报告基因的检测 随着RU486量的逐渐加大，红色荧光也随之增多；而C

19、ontrol组中仅仅看到了很少的红色荧光，见图3。荧火虫荧光素酶LUC报告基因的检测结果 10-10组的M1/M2明显高于RU486对照组，两组差异具有统计学意义（P<0.01），已达到pGL-Control对照组水平（P>0.05）；随着RU486药量的增大，M1/M2也随之增加（P<0.05），在10-9之后再加大RU486的药量LUC的表达量虽然仍在增大，但已无统计学意义（P>0.05），而10-6组的M1/M2又回落到10-10组的M1/M2水平（P>0.05）；病毒Ad-RUNEP表达-内啡肽的ELISA检测 阴性对照组-内啡肽几乎没有表达。而对于实验组

20、，当RU486剂量处于10-1010-8mol/l范围之内时，第一天-内啡肽的表达随RU486呈剂量依赖性增加（p<0.01），10-7组继续增大但与10-8组已无统计学差异，RU486加大到10-6mol/l时，-内啡肽的表达下降；第二天随着所有样本-内啡肽表达的增加（p<0.05），10-1010-8mol/l组之间已经没有差异，而10-7组表达达到最大（p<0.05），然后10-6组又有所降低（p<0.05）。然而，当样本在更换培养上清去除RU486之后两天，即第四天，ELISA检测发现各实验组样本中-内啡肽的表达量均急剧下降至120pg/ml左右，各组间已无统计

21、学差异（p>0.05）。讨 论RU486调控系统是由Wang等5在1994年首次提出的，之后为了降低其细胞毒性和免疫原性又进行了一系列的结构改进4,6，是目前较为常用的基因开关系统。它已被广泛用于各种模型中的蛋白表达，如果蝇7,8、培养细胞9、转基因大鼠10或各种病毒载体（腺病毒11、慢病毒12、单纯疱疹病毒13）等。RU486调控系统的激活过程与甾体类激素被其配体激活相似4，反式作用调控子可以在不同的组织定向启动子作用下，在各自靶向的组织或细胞进行表达。当给予RU486后， RU486与PRLBD-891相结合，促使反式作用调控子发生构象变化形成二聚体而激活，激活的反式作用调控子与目的

22、基因上游的Gal4 DNA结合区四聚体结合，从而启动目的基因的表达。反之，在没有RU486的情况下，由于反式作用调控子的构象不会发生变化，所以RU486调控系统不能被激活，即目的基因不能转录表达。这样，RU486调控系统便可根据RU486的量及给予时间，对目的基因的表达水平及其表达时程的长短进行控制。本研究采用RFP和LUC两种报告基因对RU486调控系统的功能在载体水平进行了验证。从图3中，我们可以看到随着RU486给予剂量的逐渐加大，红色荧光也随之增多，两者呈正向相关变化，说明RFP的表达量随RU486加入量呈剂量依赖性增加；而Control组中仅仅看到了很少量的模糊红色荧光，表明在未加入

23、RU486的情况下，RFP的表达极少甚或没有。这与RU486调控系统的功能完全符合，证实在我们构建的穿梭质粒载体中RU486调控系统序列完全正确，当穿梭质粒脂质体转染HEK293细胞后，RU486系统能够正常发挥作用。由于RFP报告基因只能对RU486调控系统的功能进行定性的检测，因此我们还采用了另一报告基因荧火虫荧光素酶LUC对RU486调控系统的功能进行了定量检测。从图4可以得出，随着RU486药量的增大M1/M2也随之增加（P <0.05），说明RU486可以调控报告基因LUC的表达，功能正常。然而，在10-9之后再加大RU486的药量LUC的表达量虽然仍在增大，但已无统计学意义（

24、P >0.05），当RU486的剂量达到10-7mol/l时，M1/M2比值也达到最大。而10-6组的M1/M2又回落到10-10组的M1/M2水平（P>0.05）。这可能是由于RU486直接加入细胞培养上清中对细胞产生毒性作用，当RU486剂量加大，毒性也随之加大，进而使细胞死亡增加。由于检测LUC时需要移去培养上清回收细胞，因此仅有活细胞被检测到，LUC的检测值便随之下降，影响了检测的结果。而RFP检测时，即使细胞死亡但表达的RFP仍在培养孔中，不会影响我们的观察。总之，我们构建的穿梭质粒载体中RU486调控系统的功能正常，可以调控目的基因的表达。由于在以往RU486调控系统诱

25、导各种模型蛋白表达的研究中，RU486调控系统最大效能的诱导浓度不尽相同。 Oligino等13将携带有RU486调控LacZ报告基因的单纯疱疹病毒转染含有不同剂量RU486的Vero细胞48hr后对LacZ的表达进行检测，发现RU486剂量为10-9mol/l 时表达达到高峰的一半，而10-7mol/l时表达达到最高。而Yu等14将RU486调控系统和目的基因分别装于两个质粒转染Cos细胞后24hr加入不同剂量RU486诱导，得到最大效能的RU486诱导浓度为250nmol/l，即2.5×10-7mol/l。RU486诱导慢病毒中Desred2的最大效能浓度是10-6mol/l12

26、。因此，为了得到RU486诱导第一代重组腺病毒中-内啡肽表达的最有效浓度范围，我们参照以往研究中RU486调控系统最大效能的诱导浓度，制定了本实验RU486的浓度范围，即10-610-10mol/l。研究结果显示当RU486剂量的剂量达到10-7mol/l时，-内啡肽的表达也趋于最高，但两者并未完全呈剂量依赖关系，这与运用LUC与RED两种报告基因所测得的结果有所不同，也与Wang等11的报道结果稍有差异，他们在将RU486调控携带IL12的第三代腺病毒时，发现10-1010-8mol/l范围内，IL12的表达随RU486呈剂量依赖性增加，这可能是由于转染不同细胞或调控的目的基因不同造成。在E

27、LISA定量检测-内啡肽表达含量的结果中，阴性对照组的-内啡肽仅有很少量表达，说明当没有RU486诱导时-内啡肽表达基础很低，这与以往RU486可诱导系统调控不同的病毒或转基因动物等结果均一致。而当RU486从培养上清中去除之后，每一组的-内啡肽表达量均急剧下降至较低水平，这说明当去除了RU486的诱导作用之后，调控系统关闭，-内啡肽的表达降低，基因开关作用完全。当使用10-6mol/l的RU486加入培养上清诱导时，ELISA检测发现-内啡肽的表达量比10-7mol/l组减少，与之前的LUC检测结果相似，这可能也是由于大量RU486直接加入细胞培养上清，对细胞有一定的毒性作用所造成。总之，本

28、研究中我们成功构建了携带RU486可调控-内啡肽基因的第一代复制缺陷型重组腺病毒Ad-RUNEP，并在载体和病毒水平分别验证了RU486调控系统的功能。通过控制RU486的剂量与用药长短来调控-内啡肽的表达，得到良好的效果，这也为我们之后Ad-RUNEP的体内实验奠定了理论基础。当然，-内啡肽的表达与RU486是否呈剂量依赖性相关，还必须进行体内实验来得以证实。参考文献1. 尤圣武, 俞卫锋, 于布为, 等. 重组小鼠神经生长因子前导肽和人-内啡肽融合基因非增殖型腺病毒的构建和鉴定. 中华麻醉学杂志. 2004; 24(12): 896-900.2. 尤圣武, 徐学武, 俞卫锋, 等. 鞘内注

29、射入-内啡肽基因重组腺病毒对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用. 中华麻醉学杂志. 2005; 25(6): 428-432.3. Molin M, Shoshan MC, Ohman-F orslund, et al. Two novel adenovirus vector systems permitting regulated protein expression in gene transfer experiments. J Virol. 1998 Oct; 72(10):8358-61.4. Tsai SY, Wang Y, O'Malley BW, et al. A novel

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