扶正解毒汤对硫酸镍诱导16HBE 细胞微核形成的抑制作用

1、扶正解毒汤对硫酸镍诱导16HBE 细胞微核形成的抑制作用    摘要：目的研究中药扶正解毒汤（FJD）对硫酸镍（NiSO4）诱导人支气管上皮细胞（16HBE）微核形成的抑制作用。方法分别以NiSO4暴露、FJD含药血清与NiSO4共同处理体                    摘 要：目的研究中药扶正解毒汤（FJD）对硫酸镍（NiSO4）诱导人支气管上皮细

2、胞（16HBE）微核形成的抑制作用。方法分别以 NiSO4 暴露、FJD 含药血清与NiSO4 共同处理体外培养的16HBE 细胞，观察其微核率的变化，并采用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测不同处理组细胞内镍（Ni）、镁（Mg）、锌（Zn）离子浓度及自由基含量的变化。结果与阴性对照组相比，NiSO4（400mol/L）暴露组细胞微核率、细胞内Ni2+浓度及自由基含量均明显增高（P<0.01），而细胞内Mg2+、Zn2+浓度则明显降低（P<0.01）。低、中、高剂量FJD 血清与NiSO4 共同处理后，细胞微核率分别为4.4、2.7、1.4，显著低于NiSO4 暴露组（P<

3、0.050.01），且FJD 血清的作用呈剂量效应关系（r=0.734,P<0.05）；同时，与NiSO4暴露组相比，细胞内Ni2+浓度及自由基含量下降，Mg2+、Zn2+浓度升高（P<0.050.01），接近阴性对照组。结论 FJD 对镍诱导16HBE 细胞微核形成有明显的抑制作用，其机制可能与调节染镍细胞内某些金属元素含量变化及清除自由基有关。关键词：扶正解毒汤，含药血清，硫酸镍，微核，离子，自由基镍化合物为一类多系统、多器官、多细胞毒物及人类确证致癌物。体外实验研究证实，硫酸镍（NiSO4）等水溶性镍化合物可通过自由基作用等机制诱导哺乳类及啮齿类细胞染色体畸变，姐妹染色单体交

4、换，基因突变，DNA 断裂，细胞恶性转化及癌变1，2。近10 余年来，本课题组已开展了以复方中药扶正解毒汤（FJD）拮抗镍毒性的系列研究，结果表明，FJD 对NiSO4 暴露大鼠及慢性镍暴露人群的多器官损伤具有显著的拮抗作用3，4。本研究在建立NiSO4 暴露诱导培养人支气管上皮细胞（16HBE）微核形成模型的基础上，首次从体外途径研究FJD 对NiSO4 遗传毒性的抑制作用及其可能的机制，旨在为中医药防治重金属毒临床研究提供新的理论依据。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞及动物16HBE（美国ATCC），纯种青紫兰兔16 只，雄性，体重（2.1±0.3）kg，由中国兰州生

5、物制品研究所提供（合格证号：14004），常规饲养。1.2 中药 FJD 由红芪、茯苓、丹参、枸杞、当归、莪术、连翘按4:4:3:3:2:2:2 组方，生药由甘肃省药材公司提供，经鉴定全部符合中华人民共和国药典规定。上药混合，加三蒸水煎煮，制备成含生药4g/ml 药液，4保存备用。1.1.2 主要试剂及设备分析纯 NiSO4、丝裂霉素（MMC）、荧光染料acridine orange(AO)（Sigma 公司），MEM 培养基、胰蛋白酶、（GIBCO 公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），镍离子探针Newport Green DCF(N-7991)、镁离子探Mag-fluo-4AM(

6、M-14206)、锌离子探针Zinc GreenIndication(Z-6901)、自由基探针乙酰乙酸盐-2，7-二氯氢化荧光素（D-399）（美国Molecular Probe Inc.），Lx-50 型荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS），TCS sp2型激光扫描共聚焦显微镜系统（德国Leica），MCO-15AC 型CO2 恒温培养箱（日本SANYO），FD-1 型冷冻干燥机（北京博医康技术公司）。1.2 方法1.2.1 FJD 含药血清冻干粉的制备 FJD 高、中、低剂量血清组分别以FJD11、5.5 和2.75gkg-1d-1 灌胃（给药中剂量临床常用量×动物等效面积系数

7、×培养基内血清稀释度，高、低剂量分别为中剂量乘以及除以2），空白血清对照组（简称空白血清）予以生理盐水。各组每日分2 次等体积灌胃（灌胃前禁食，自由取水），共3d，于末次灌胃后2h 心脏采血，室温下静置4h，2400r/min 离心10min，分离血清，0.22m 微孔滤膜过滤，56水浴灭活后，在70条件下，以超低温冷冻干燥机制成不同剂量的含药血清冻干粉，20贮存备用。1.2.2 细胞培养及受试物的配制 16HBE 细胞用含10小牛血清和青霉素、链霉素的MEM培养基，在37，5CO2 饱和湿度的环境中培养。细胞按1.0×104/cm2 密度接种。隔日换液，每34d 按1:4

8、 比例传代1 次。NiSO4 以不含小牛血清的MEM 培养液配成系列浓度，高压消毒。实验终浓度分别为50、100、200、400、800mol/L。低、中、高剂量FJD 血清及空白血清冻干粉以不含小牛血清的MEM 培养液溶解稀释，实验终浓度均为10（体积分数）。分别以丝裂霉素（MMC）和不含小牛血清的MEM 培养液作为阳性对照和阴性对照。1.2.3 细胞毒性实验接种 500 个16HBE 细胞于25ml 培养瓶中，培养24h，按实验分组加入受试物，每个剂量设5 个平行样。在37，5CO2 条件下培养24h，弃去培养液，以无菌PBS 洗涤细胞两次，加入新鲜完全培养液继续培养7d。用甲醇固定细胞1

9、0min，10Giemsa染色，计数形成的克隆数，并计算绝对克隆形成率（CFE）和相对克隆形成率（RFE）5。CFE（）（克隆数/接种细胞数）×100RFE（）（处理组CFE/阴性对照组CFE）×100选择 RFE 为1090范围内的一个浓度作为NiSO4 诱导微核形成的实验浓度。1.2.4 体外微核试验取对数生长期的16HBE 细胞接种于25cm2 培养瓶内，每瓶接种的细胞数为2.5×105，培养24h 后，换以不含小牛血清的MEM 培养液，按实验分组加入受试物，继续培养24h，胰蛋白酶消化细胞，800r/min 离心5min 后用0.075mol/LKCL 处

10、理细胞，再次离心后加入固定液（冰醋酸与甲醇按31 配制），600r/min 离心8min，再次重复固定2次，滴片，风干。荧光显微镜镜检之前，AO 染色。每组样本制片2 张，将带有1 个典型微核、带有1 个大微核（直径大于主核直径的1/4）及带有多个微核（无论大小）的细胞作为微核细胞计数。每片至少计数500 个单核细胞。计算每个样本1000 个细胞中微核细胞率（，简称微核率）。1.2.5 16HBE 细胞内Ni2+、Mg2+、Zn2+浓度及自由基含量的LSCM 检测受试物处理方法同微核试验。细胞经受试物处理并继续培养24h 后，以PBS 洗涤2 次，胰蛋白酶消化，离心，弃上清，然后以新鲜完全培养

11、液制备细胞悬液，分装。取预先溶解的N-7991、M-14206、Z-6901、D-399 四种探针稀释液（5mol/L）各1ml，加至各组细胞悬液中，终浓度均为1.25mol/L。37水浴箱中孵育40min，加PBS 洗涤，1000r/min 离心10min，重复3 次，重悬细胞于PBS 中，滴片，盖片。设定LSCM 检测条件（见表1），在40×高倍镜下，每组选取5 个最佳清晰的荧光图像以点面2×6 方式扫描。扫描图像存入计算机硬盘内，分析试重新读出。数据分析采用LSCM 图像处理系统，以荧光像素数代表离子浓度及自由基含量。1.3 统计学方法以 SPSS10.0 统计软件分

12、别对数据进行poisson 分布分析、F 检验及相关分析。2. 结果2.1 受试物对16HBE 细胞的毒性（见表2） 由表 2 可见，NiSO4 组CFE 和RFE 随其浓度增加而降低，呈剂量反应关系。高剂量FJD 血清及空白血清本身对16HBE 细胞无毒性效应，高剂量FJD 血清的加入也对NiSO4（400mol/L）的细胞毒性无明显影响。参照文献6，选择400mol/L 作为诱导16HBE 细胞微核形成的实验浓度。2.2 FJD 对NiSO4 诱导16HBE 细胞微核形成的抑制作用（见表3） 由表 3 可见，NiSO4（400mol/L）暴露的16HBE 细胞其微核率显著高于阴性对照组（P

13、<0.01），低、中、高剂量FJD 血清与NiSO4 共处理组细胞微核率分别为4.4、2.7、1.4，均低于NiSO4组（P<0.050.01）；FJD 血清的作用呈剂量效应关系（r=0.734,P<0.05）。2.3 FJD 对镍暴露16HBE 细胞内离子浓度及自由基含量变化的影响（见表4） 与阴性对照组相比，NiSO4（400mol/L）暴露组细胞内Ni2+浓度及自由基含量明显增加，Mg2+、Zn2+浓度降低（P<0.01），而经FJD 血清与NiSO4 共同处理后，Ni2浓度及自由基含量降低，Mg2+、Zn2+浓度升高（P<0.050.01），尤以高剂量FJ

14、D 血清作用明显，接近阴性对照水平。3. 讨论微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法，可检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。业已证实，NiSO4 可诱导培养V79 细胞及SHE 细胞微核形成7。本研究采用体外微核试验方法，证实NiSO4（400mol/L）亦可诱导人支气管上皮细胞微核形成，同时发现，染镍16HBE细胞内Ni2+浓度及自由基含量异常增高，而Mg2+、Zn2+浓度降低，此与文献报道较为一致8，9。提示，细胞内Ni 的过量摄入，部分二价金属元素的失衡状态以及氧化应激的存在，可能为NiSO4 遗传毒性的基础。FJ

15、D 中红芪、当归、丹参、枸杞益气养血，莪术、茯苓、连翘化瘀利湿解毒，体现了中医学“扶正祛邪”的治则思想。本研究首次以FJD 含药血清冻干粉进行镍遗传毒性干预的体外研究。结果表明，FJD 血清对NiSO4 诱导16HBE 细胞微核形成具有显著的抑制作用。其可能机制为：（1）金属元素间的相互作用。二价金属元素间存在相互拮抗性。FJD 中富含Mg、Zn 等元素，而Ni 含量甚微10。加入FJD 后，一方面纠正了染镍细胞内Mg、Zn 的失衡状态，使细胞内环境保持稳定，另一方面，补充的Mg、Zn 可竞争性抑制或减弱细胞内Ni 的摄入，Ni2+与DNA 以及DNA 复制酶、DNA 修复酶的特异性结合，从而保护染色体免受损伤，维持了基因组的稳定性1。（2）清除自由基、抗氧化作用。现代药理学研究已证实，FJD 七种中药中均含有抗氧化、清除自由基、抗诱变及一定的抗癌成份，而本身无明