特异性DC疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效及治疗后血清ICAM-1、ICAM-3水平的研究

1、特异性DC疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效及治疗后血清ICAM-1、ICAM-3水平的研究         【摘要】  目的检测特异性DC疫苗治疗慢性乙型肝炎患者前后HBV-DNA的变化，及治疗后疗效好与疗效差者血清ICAM-1、ICAM-3的水平的变化，探讨DC疫苗疗效及其影响因素。方法选取慢性乙型肝炎患者37例，抽取患者外周血，分离树突细胞行体外培养、扩增后以表面抗原致敏，制备成特异性DC疫苗，自体回输，回输2次为1个疗程（间隔2周），每位患者均治疗2个疗程。检测治疗前后患者HBV-DNA的变化，检测治疗后疗

2、效好与差者血清ICAM-1、ICAM-3水平的变化。结果37例慢性乙型肝炎患者经DC疫苗治疗后，19例HBV-DNA载量下降2.0log10,18例HBV-DNA载量下降2.0log10,有效率51.4%（2=25.56,P0.001）。血清ICAM-1、ICAM-3水平，在有效与无效两组间比较差异无显着性（P0.05）。结论特异性DC疫苗治疗慢性乙型肝炎，可显着降低HBV-DNA载量，ICAM-1、ICAM-3可能不是影响其疗效的主要因子。 【关键词】  特异性DC疫苗 ICAM 树突细胞 乙型肝炎   【Abstract】ObjectiveTo observe

3、 the efficacy and changes of HBV-DNA, ICAM-1 and ICAM-3  in chronic hepati-tis B patients treated with specific DC vaccine. MethodsThe subjects were taken peripheral blood dendritic cells from 37 chronic hepatitis B patients, DCs were cultured and proliferated in vitro with HBsAg to prepare the

4、 specific DC vaccine, and transfused twice for a course of treatment （interval 2 weeks）. After two courses of treatment, changes of HBV-DNA, ICAM-1 and ICAM-3 were observed. ResultsAfter DC transfusion, the levels of HBVDNA in 19 cases were decreased2.0 log 10. The effective rate was 51.4% （2=25.56,

5、 P0.001）. There was no obvious differences in levels of ICAM-l and ICAM-3 （P0.05）. ConclusionSpecific DC vaccine can obviously decrease the level of HBV-DNA. Perhaps ICAM-1 and ICAM-3 are not the main factors.   【Key words】specific DC vaccine; cell adhesion molecules; dendritic cells; hepa

6、titis B   自1970年至今，随着树突细胞的发现及对树突细胞（DC）的体外分离、扩增和培养技术方面的基础研究，DC用于乙型肝炎的治疗在动物、体外及临床试验中，取得了很好的疗效13。目前已经成为临床研究的一个“热点”，但在临床的应用中仍缺乏有力的依据，本实验通过体外分离、培养、扩增慢性乙型肝炎患者外周血的DC，以HBsAg致敏，制成特异性DC疫苗，经皮下行自体回输，观察特异性DC疫苗治疗前后患者HBV-DNA及治疗后血清ICAM-1、ICAM-3水平，判定DC治疗慢性乙型肝炎的疗效，通过对特异性DC疫苗治疗后疗效好与疗效差的慢性乙型肝炎患者血清ICAM-1、ICAM-

7、3水平的比较，了解其是否为影响DC疫苗疗效的主要因子。为临床DC治疗慢性乙型肝炎提供理论依据。   1材料与方法   1.1材料   1.1.1研究对象选取2004年5月2007年5月河北医科大学第一医院肝病中心门诊或住院慢性乙型肝炎患者37例，其中男30例，女7例；年龄1863岁，平均37岁。所有病HBV-DNA均1.0×105copies/ml。入选患者无其他病毒合并感染及严重并发症，治疗前半年内未使用过任何抗病毒及调节机体免疫的药物，全部获得了知情同意。诊断标准符合2000年修订的病毒性肝炎防治方案4及2005年慢性乙

8、型肝炎防治指南。   1.1.2主要试剂   1.1.2.1DC疫苗制备试剂rhGM-CSF、rhIL-4、RPMI1640培养液、鼠抗人CD40，CD83，购于河北博海生物工程有限公司，HBsAg购于中国预防医学科学院病毒所。   1.1.2.2ELISA试剂ICAM-1、ICAM-3 ELISA试剂盒，国外生产国内组装，试剂号分别为EIA05821，QRCT-225998EIA/UTL。   1.1.2.3主要仪器CO2培养箱（Thermo Forma,美国），倒置显微镜（Olympus,日本），可在450mm

9、处进行计数的全自动酶标仪（Thermo,芬兰），37恒温箱（SBHW-IV，北京），可调多道移液器及枪头（EPPENDORF，德国），离心机（LD-25-2，北京），振荡混匀器（XW-80A，上海）。   1.2实验方法采用自身前后对照实验，在无菌条件下抽取受试者外周静脉血20ml，肝素抗凝，在百级实验室进行下面操作：生理盐水1：1稀释抗凝血，层加到淋巴细胞分离液2000r/min离心30min，分离出外周血单核细胞并计数，用1640液选2次，再加入含有体积分数150ml/L入AB血清的1640完全培养基重悬细胞，以2×109/L的细胞浓度加入一次性6孔培养板中，

10、于37 50ml/L CO2 饱和湿度下培养4h,弃上清液，再用1640培养液轻洗2次，除去非贴壁细胞，加入含8335Kat/L rhGM-GSFt 8335kat/L rhIL-4的完全培养基，隔日换液，培养至第6天再加入终浓度为2.5mg/L的HBsAg，4h后加入终浓度为10g/L的TNF，继续在37 50ml/L CO2饱和湿度下培养1天，收获DC用生理盐水洗涤2次并计数，即刻在受试者腋下部位常规消毒后经皮下注入体内。同时取细胞洗液做无菌实验。回输2次为1个疗程（间隔2周），每名患者均治疗2个疗程。分别检测治疗前及治疗结束1月后患者HBV-DNA。留取患者治疗结束后的血清，冻存于-86

11、冰箱。用ELISA法集中检测ICAM-1、ICAM-3。   1.3统计学处理计量资料用x±s表示，进行t检验、计量资料进行2检验，全部资料均用SAS8.1软件处理。            2结果   2.1DC疫苗治疗前后病毒学应答情况37例患者DC治疗前后HBV-DNA下降2.0log10的19例，有效率51.4%。见表1。表1DC疫苗治疗前后病毒学应答情况   2.2回输后血清ICAM-1、ICAM-3的水平见表2、表3

12、。DC治疗后有效者19例，无效者18例，对两组间ICAM-1、ICAM-3分别进行T检验，ICAM-1方差齐性检验：P=0.13720.1,方差齐。T检验：t=0.33,DF=31,P=0.74210.05,差异无显着性。ICAM-3方差齐性检验：P=0.12230.1,方差齐。T检验：t=1.49,DF=31,P=0.14750.05,差异无显着性。表2DC疫苗治疗后血清ICAM-1水平在两组间比较 表3DC疫苗治疗后血清ICAM-3水平两组间比较   3讨论   树突细胞（dendritic cells,DC）是由美国学者Steinman于1973年

13、发现的，是目前所知的机体内功能最强大的抗原提呈细胞57。DC是机体免疫应答的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特的地位。它是抗原与T细胞之间的“桥梁”，可通过MHC类和类分子递呈病毒肽，从而激活CD4+T、CD8+T细胞。但在慢性乙型肝炎病人中，DC在数量以及功能上都存在不同程度的改变，抗原提呈及分泌细胞因子等功能受到不同程度的抑制。DC的质量及功能的改变会导致Th1/Th2失衡及细胞免疫功能低下，这是引起HBV感染慢性化发生的主要原因8。在实验通过体外分离、培养、扩增慢性乙型肝炎患者外周血的DC，以HBsAg致敏，制成特异性DC疫苗，经皮下行自体回输，观察特异性DC疫苗治疗前后患者HBV-DN

14、A变化，发现37例慢性乙型肝炎患者中19例病毒载量下降2.0log10，有效率51.4%（2=25.56,P0.001）。提示特异性DC疫苗可有效降低慢性乙型肝炎患者的病毒载量，为治疗慢性乙型肝炎的有效方法之一。粘附分子（cell adhesion molecules,CAM）是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称。CMA以受体-配体结合的形式发挥作用，使细胞与细胞间，细胞与基质间，或细胞-基质-细胞间发生粘附，参与细胞的识别，细胞的活化和信号转导，细胞的增殖与分化，细胞的伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。根

15、据其结构特点可分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、钙粘蛋白家族及一些尚未归类的粘附分子。主要功能为：（1）免疫细胞识别中的辅助受体和协同活化信号；（2）炎症过程中白细胞与血管内皮细胞粘附；（3）淋巴细胞归巢等。ICAM-1及ICAM-3隶属于免疫球蛋白超家庭，ICAM-3是体内重要的协同刺激分子，介导T细胞与抗原提呈细胞（APC）细胞之间的粘附及参与树突细胞与T细胞相互作用，诱导T细胞早期活化、粘附和增殖，在乙型肝炎的免疫过程中亦为重要角色。本实验显示DC治疗后血清中ICAM-1、ICAM-3在有效与无效两组间比较差异无显着性（P0.05）。这与部分文献描述不相符9，10，提示ICA

16、M-1、ICAM-3可能不是影响DC疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效的主要因子，或是由于观察例数较少，或由于患者个人体质的差别等因素造成。人体免疫系统是一个复杂的网络系统，应进一步做多因素研究，了解免疫细胞、免疫因子等诸多因素之间的交互作用。【参考文献】  1蒲骁麟，束永前，张锦英.抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响.江苏大学学报，2005，15（1）：6-9.2李用国，罗云萍，兰英华，等.树突细胞HBsAg疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的体外研究.中华传染病杂志，2002，20（6）：333-336.3佟立新，刘树贤，郭力红，等.自体树突细胞联合抗病毒治疗对HBV慢性感染者的临床效应

17、.世界华人消化杂志，2007，15（11）：1232-1236.4中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8：324-329.5王全楚，聂青和.树突状细胞.实用肝脏病杂志，2003，6（3）：151.6罗道升.树突细胞相关基础研究进展.国外医学·免疫学分册，2005，28（1）：51-55.7Sk Md Fazle Akbar,Norio Horiike,Morikazu Onji.Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection.World J Gastronterol,2006,12（18）:2876-2883.8辛永宁，宣世英，孙樱.慢性乙型肝炎TH1/TH2细胞的免疫功能研究进展.临床肝胆病杂志，2005，2