盐酸罗格列酮对糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖及分泌NO的

1、盐酸罗格列酮对糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖及分泌NO的影响    【摘要】  目的：探讨盐酸罗格列酮对糖基化终产物（AGEs）诱导新生大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖及分泌一氧化氮（NO）的影响。方法：采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取CFs，应用MTT 法、流式细胞术（FCM）分别观察不同浓度盐酸罗格列酮对AGEs作用下CFs的细胞增殖、细胞周期的影响；硝酸还原酶法分别测定不同条件下CFs培养液中的NO水平。结果：AGEs对CFs的增殖有显著的促进作用；不同浓度的盐酸罗格列酮干预后，与AGEs组对比A值均明显下降（P<0.05）；

2、S期及G2/M期细胞百分值明显低于AGEs组，而G0/G1 期的细胞百分值增高（P<0.05），且随着浓度的增加，抑制细胞增殖作用越显著。AGEs抑制CFs分泌NO，盐酸罗格列酮可阻断AGEs的上述作用，并呈一定的浓度依赖关系（P<0.01）。结论：在一定浓度范围内，盐酸罗格列酮呈剂量依赖性地抑制AGEs诱导的大鼠CFs增殖，并阻断 AGEs抑制CFs分泌NO。 【关键词】  盐酸罗格列酮;糖基化终产物;心肌成纤维细胞;一氧化氮   糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs) 在体内积聚是导致糖尿病慢性并发症

3、发生发展的重要原因之一1。糖尿病心肌病变是糖尿病的主要并发症之一。近年来已认识到心肌成纤维细胞（CFs）和心肌间质在心肌重构中起着不可忽视的作用，研究发现，CFs具有分泌多种生物活性物质的能力2。近来大量资料提示内皮素、一氧化氮(nitricoxide，NO)等一些生物活性物质与心肌纤维化的发生、发展密切相关3。噻唑烷二酮类(TZDs)降糖药对AGEs诱导CFs增殖及分泌NO的影响未见报道。 1  材料与方法 1.1  材料 SD大鼠乳鼠由南京军区总院实验动物中心提供,胎牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)、DMEM干粉培养基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Gibco 公司

4、)、四氮唑蓝(MTT，Gibco公司)均购于南京创瑞生物技术有限公司，NO含量测定试剂盒购于南京建成生物公司，AGEs由东南大学医学院心血管病研究所提供，盐酸罗格列酮（维戈洛）由上海三维制药公司惠赠。 1.2  CFs的分离、培养和鉴定无菌条件下取下新生14龄SD大鼠乳鼠(雌雄不限)心室，浸入D?Hanks液中剪碎，用0.06%胰蛋白酶于37水浴并在磁力搅拌器上(速率100 r·min-1)分次消化成单细胞悬液。此时细胞悬液的主要成分是搏动的心肌细胞及CFs，利用CFs能更快更早贴壁的特点将两种细胞分离。经两次差速贴壁后，首次先贴壁的为成纤维细胞，用含体积分数为0.1的胎牛

5、血清的DMEM培养液培养至融合状态时进行传代，第2代细胞按每毫升5×104个细胞数量均匀接种培养。使用倒置显微镜观察两种细胞的形态，用血细胞计数板和台盼蓝染色进行活细胞计数。经倒置显微镜、透射电镜确认，SABC免疫组化染色示纤维粘连蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白因子和结蛋白染色阴性，证实所培养的细胞为CFs，实验采用24代细胞。1.3  实验分组实验中将24代CFs分为空白对照、AGEs（100mg·L-1）、AGEs加盐酸罗格列酮0.1 mmol·L-1、AGEs加盐酸罗格列酮1.0 mmol·L-1和AGEs加盐酸罗格列酮10.0 mmo

6、l·L-15组。 1.4  MTT法检测细胞数取对数生长的CFs，2.5 g·L-1胰酶消化，用含10胎牛血清的DMEM调节细胞密度为2.5×107 L-1，加入96孔培养板中接种，每孔200 l，静置培养至细胞贴壁、伸展，分别加入100mg·L-1 AGEs及不同浓度盐酸罗格列酮培养48h后，每孔加入10 l MTT溶液(5g·L-1)，37继续培养4小心吸弃培养液上清，每孔加入二甲基亚砜150l，振荡混匀10min，测490nm 值。 1.5  细胞周期测定细胞经传代并加入不同试剂培养24后，将单层培养细胞(对数生长期)

7、用胰酶消化。加入34ml无钙、镁离子的PBS液，用吸管反复操作使成为单个细胞悬液，调细胞密度为1×109 L-1，离心，去上清，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。使用细滴管将细胞迅速注入4 70冷乙醇中，4保存。调整细胞密度为 1×109 L-1，碘化丙锭染色15min后用FACS440型流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）进行细胞周期分析，计算机处理后得出各期细胞数目及其占总细胞数的百分比。 1.6  NO含量测定 NO在体外转化为NO-2和NO-3，利用硝酸还原酶将NO-3还原为NO-2，通过显色深浅测定NO-2浓度来推算NO含量。操

8、作按试剂盒说明进行，NO含量以公式（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×100mol·L-1计算。1.7  统计学处理用SAS统计软件进行处理，所有数据以x-±s表示，除细胞周期以百分值表示并用2检验外，其它数据采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，P<0?05为差异有显著性。    2  结    果 2.1  盐酸罗格列酮对AGEs作用下CFs细胞增殖的影响    与AGEs组相比，随着盐酸罗格列酮

9、浓度的增加，A值明显下降，详见表1。2.2  盐酸罗格列酮对AGEs作用下CFs细胞周期的影响    流式细胞仪检测示AGEs组S期及G2/M期细胞百分值明显高于对照组（P<0.01）,而盐酸罗格列酮干预组均不同程度地被抑制（P<0.05），且随盐酸罗格列酮浓度的增加，抑制作用增强，增殖期细胞的百分值越接近对照组，见表1。2.3  盐酸罗格列酮对AGEs作用下CFs分泌NO的影响     3  讨    论 心肌纤维化与多种内源性的神经内分泌和细胞因子的激活有关，

10、CFs是心肌纤维化的主要效应细胞。NO是强舒张血管、抑制心肌纤维化的活性物质，在病理条件下，如高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化和心力衰竭等都有NO的储备或基础NO的减少4。心脏中的NO除引起冠状血管舒张、调节冠脉供血等一系列效用外，还可通过自分泌和(或)旁分泌的途径抑制CFs增生和胶原合成，改善心肌纤维化，故CFs合成的NO是一种重要的抗心肌纤维化因子 5。AGEs干预下CFs分泌NO的变化，及其与心肌纤维化的关系尚不清楚。罗格列酮属胰岛素增敏剂，是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 的人工合成配体，TZD与PPAR结合后通过调节核因子B(NF?B)抑制其下游靶基因(如TGF?、PAI

11、?1、?SMA和?FABP)的表达，从而发挥了抗纤维化的作用6。本研究结果显示，培养的新生大鼠 CFs与心肌细胞、内皮细胞一样能分泌NO；并且AGEs组的CFs培养液中NO含量较对照组明显降低(P<0.01)，提示AGEs具有抑制 CFs分泌NO的作用,盐酸罗格列酮可阻断AGEs对CFs分泌NO的抑制作用，提示盐酸罗格列酮抑制CFs增殖的作用可能与NO有关。( ) 【参考文献】  1HIARELLI F，de MARTINO M，MEZZETTI A，et al.Advanced glycation end products in children and adolescent

12、s with diabetes:relation to glycemic control and early microvascular complicationsJ.J Pediatr,1999,134(4):486?491. 2HARADA M，ITCH H，NAKAGAWA O,et al.Significance of ventricular myocytes and nomyocytes interaction during cardiocyte hypertrophyJ.Circulation，1997，96(10):3737?3744. 3MIYAUCHI T，MSAKI T.P

13、athophysiology of endothelin in the cardiovascular systemJ.Annu Rev Physiol，1999，61:391?415. 4TANK C，CHOW S，AIV H，et al.Advanced glycation end products and endothelial dysfunction in type 2 diabetesJ.Diabetes Care，2002，25(6):1055?1059. 5CHUN T Y，BLOEML J，PRATT J H.Aldosterone inhibit inducible nitric oxide synthase in neonatal rat cardiomyocytesJ.Endocrinol，2003，144(5):1712?171