聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。看了好多观点以后，不如自己做一个实验来分析。更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析：明确实验目的：1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。2. 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。3. 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。了解实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr ）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis ）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离

2、取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-910-12g 样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广

3、泛的凝胶电泳。不连续是指电泳的pH 值不连续（样品浓缩胶缓冲液pH 6.8, 电极缓冲液pH 8.3, 分离胶pH 8.8）、凝胶不连续（一般分成样品浓缩胶和样品分离胶两层）。变性是指样品蛋白经SDS 和巯基乙醇作用后，所有蛋白质都解聚成为其构成亚基，并且都带上负电荷，形状都近似于长椭园棒状。这种SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度，二者决定凝胶分子筛的孔径大小，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙

4、烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围（*双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29）*丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD ）15107.55.0实验准备：一、器材1. 垂直平板电泳仪全套。2. 刻度吸管、三角烧瓶、加样枪等。二、试剂 1243 1668 3694 572121.30%丙烯酰胺/N, N-亚甲双丙烯酰胺 以温热去离子水配制成含29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，过滤后入棕色瓶中置4oC 冰箱贮存。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会在光催化或碱催化下缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，故溶液的pH 值不亦超过7.0，

5、且应免光保存。一般在棕色瓶、4oC 冰箱条件下可保存数月。小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。2. 十二烷基硫酸钠（SDS ） SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液于室温保存。3.TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺 TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合，TEMED 原液可在4oC 冰箱保存。4、10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。注意：10%过硫酸铵必须新鲜配制，现用现配。5.4×1.5mol/L Tris（pH8.8）贮存液（稀释4倍即为分离胶缓冲液）在300ml 去离子水

6、中溶解91g Tris碱（3mol/L），用1mol/L HCl调pH 至8.8，加去离子水定溶至500ml ，滤纸过滤后置40冰箱保存。6.4×1 mol/L Tris（pH6.8）贮存液（稀释4倍即为浓缩胶缓冲液）在40ml 去离子水中溶解6.05g Tris碱（0.5mol/L），用1mol/L HCl调pH 至6.8，加去离子水定溶至100ml ，滤纸过滤后置40冰箱保存。7.5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液（稀释5倍即为Tris-甘氨酸电泳缓冲液）在900ml 去离子水中溶解15.1g Tris碱和94g 甘氨酸，然后加入50ml 10%（w/v）电泳级SDS

7、 贮存液，用去离子水定溶至1000ml 。8.2×SDS凝胶加样缓冲液100mmol/L Tris-HCl(pH 6.8200 mmol/L DTT（二硫苏糖醇）或10% 巯基乙醇4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20%甘油9. 染色液在90ml 甲醇：水（1:1，w/v）和10ml 冰醋酸混合液中溶解0.25g 考马斯亮蓝R250，用Whatmman 1号滤纸过滤后室温保存。10.脱色液 30% 甲醇+10% 冰醋酸+60%H2O 2实验步骤：1. 配制SDS 聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂（见试剂部分）2. 分离胶的灌制（1）根据厂家说明书安装好玻璃板和电泳槽。（2）竖直电泳槽，用融

8、化的1琼脂封住电泳槽的缝隙。（3）确定所需分离胶溶液的体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。配胶且寸先加其它试剂，再加过硫酸胺，最后加TEMED 。一旦加入TEMED 后，立即快速旋动混合物并进入下一步制胶操作。溶液成分凝胶浓度8%:水30%丙烯酰胺1.5M Tris(pH 8.810% SDS10%过硫酸胺 总体积5ml 总体积10ml 总体积15ml 总体积20ml 总体积25ml 总体积 30ml 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml 1.

9、3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3mlTEMED 0.003ml 0.006ml 0.009ml 0.012ml 0.015ml 0.018ml 凝胶浓度10%:水30%丙烯酰胺1.5M Tris(pH 8.810% SDS10%过硫酸胺 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml 1.3ml 2.5ml 3.

10、8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml（4）迅速在两玻璃板间隙中灌注丙烯酰胺混合溶液, 留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm 。再在胶液面上小心注入一层水（约12mm 高），以阻止氧气进入凝胶溶液，加速凝胶形成。（5）分离胶聚合完成后（约30分钟），倾出覆盖水层，用滤纸吸净残余水分，再进行下一步浓缩胶的制备。3. 浓缩胶

11、的灌制（1）按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED ，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液溶液成分水30%丙烯酰胺 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml1MTris(pH 6.8 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml10% SDS10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.

12、05ml 0.06ml 0.08ml 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml0.005ml 0.006ml 0.008ml TEMED 0.003ml 0.004ml（1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, 并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。（2）浓缩胶聚合完成后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。4. 样品制备取0.5ml 稀释血清（血清用H 2O 2稀释一倍）加入0.5ml 2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，在100水浴

13、中加热3分钟使蛋白质变性。10,000rpm 离心1分钟，取上清加样。5. 加样及电泳用长皮头吸嘴吸取处样品50l ，从加样孔底部缓慢加样。注意：加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。6. 接电源与电泳上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V 电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V （凝胶上所加电压约为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm （约23小时），然后关闭电源，取出插头。7. 取胶 从电泳装置上御下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。8. 染色与脱色用考马斯亮蓝染液对SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色12小时后，用脱色液在脱色摇床上脱色34次，每次2030分钟。血清蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可以产生十多条色带。实验注意事项1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。2. 过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4OC 冰箱贮存不超过48小时。3. 灌制凝胶时