丹酚酸 B 清除 DPPH 有机自由基活性及影响因素研究

1、(药理药化(收稿日期:2006204221;修订日期:2006208212基金项目:江苏省高校自然科学研究资助项目(No .05KJB330083作者简介:柳艳(19822,女(汉族,江苏镇江人,现为南京医科大学2004级硕士研究生,学士学位,主要从事营养与功能成分分析研究工作.3通讯作者简介:李磊(19682,男(汉族,河南商丘人,现任南京医科大学公共卫生学院教授,博士学位,主要从事天然产物功能成分分析研究工作.丹酚酸B 清除DPPH 有机自由基活性及影响因素研究柳艳,李磊3,赵鸿雁(南京医科大学公共卫生学院,江苏南京210029摘要:目的探讨丹酚酸B 清除DPPH 自由基的活性及其影响因素

2、。方法运用自由基反应模型观察丹酚酸B 对DPPH 自由基的淬灭效应。结合高效液相色谱技术分别研究温度和pH 值对丹酚酸B 清除DPPH 能力的影响。结果在设定的反应体系下,丹酚酸B 能有效清除DPPH 自由基。相同浓度下其清除能力高于二丁基羟基甲苯(BHT 和抗坏血酸(A s A 。热处理后,丹酚酸B 含量和清除DPPH 自由基能力有不同程度下降。pH =3时丹酚酸B 含量相对稳定,其清除能力较其它环境显著增加。结论丹酚酸B 具有清除DPPH 自由基的能力。温度对其含量和抗氧化能力有较大影响。酸性条件有利于丹酚酸B 的稳定性和清除能力的增强。关键词:丹酚酸B;1,12二苯基222苦肼基自由基;

3、清除;抗氧化中图分类号:R285.5文献标识码:A 文章编号:100820805(20061222406202Study on the Scaveng i n g Acti v ity and I nfluence Factors of Sa lv i a noli c Ac i d B to D PPH Free Rad i ca lsL I U Y an,L IL ei 3,ZHAO H ong 2yan (College of Public Health of N anjing M edica l U niversity,N an jing 210029,China Abstract:O

4、 bjecti ve To study on the scavenging activity and influence fact ors of salvianolic acid B t o 1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl (DPPH free radicals .M ethods Free radical model was e mp l oyed t o investigate the scavenging activity t o DPPH,and the BHT and ascorbic acid (A s A were deter m ined

5、in parallel experi m ents .The effects of te mperature and pH value on the content of salvianolic acid B and its activity was studied by H igh Perfer mance L iquid Chr omat ography (HP LC .Results Salvianolic acid B had the effective scavenging activity under the DPPH free radical -scavenging syste

6、m s,compared with the BHT and A s A.Great significance was observed under the different heating te mperature and pH value .The good activity of anti oxidant potentials was gained under pH 3.Conclusi on Salvianolic acid B has a str ong anti oxidant activity,and anti oxidant activity of salvianolic ac

7、id B is affected significantly by heating ,and stable under acidic conditi ons .Key words:Salvianolicacid B;1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl;Scavenger;Anti oxidant activity自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程,是血管损伤、细胞癌变的原始引发机制之一。清除自由基、提高机体抗氧化能力,是许多药物防治慢性疾病的重要机理1。作为我国防治心脑血管病的传统药物,丹参Salvia m iltiorrhiza Bunge 具有祛淤止痛

8、、活血通经、清心除烦的功效,对冠心病、高血压病、糖尿病肾病及癌症等疗效确切2。近20多年来的研究表明35,丹酚酸是丹参活血化淤作用的主要功能成分。丹酚酸对多种原因产生的氧自由基、羟自由基等表现出较强的清除作用,可能是丹参具有多种药理作用的机理之一。丹酚酸的种类多,在丹参中的组成和含量不同。其中,丹酚酸B (salvianolicacid B,Sal B,图1含量最多,功效显著5。2005版中国药典已将其列为丹参及丹参中成药的药效指标成分2。由于Sal B 结构中含有邻苯二羟基,性质较不稳定。在水溶液中邻二酚羟基的电荷密度增大,易解离形成氧负离子,发生自动氧化生成有色醌类物质6。同时由于处理条件

9、不同,Sal B的结构也可能发生变化,从而影响其生物活性7。本文利用自由基反应模型观察丹酚酸B 对1,12二苯基222苦肼基自由基(1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl,DPPH 自由基的淬灭效应,并结合高效液相色谱(HP LC 技术分别研究温度和pH 值对丹酚酸B 清除DPPH 能力的影响。以探讨Sal B 抗氧化能力的另一作用途径及其影响因素。为以丹酚酸B 为功效指标的新药创制及药效机理研究提供依据。1材料与方法1.1仪器及色谱条件岛津LC 210A 高效液相色谱仪;BACK 2MAN DU600紫外2可见分光光度计;北京长风8002型电热恒温水箱;LDZ5

10、22低速自动平衡离心机;上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发器RE 252AA 。图1丹酚酸B 的结构(分子量718A llti m a C 18(150mm ×4.6mm,5m 色谱柱,流动相为水(0.5%冰醋酸(A 2乙腈(B (7525,v /v ,流速1.0m l/m in,柱温为室温,检测波长290n m,进样量20l 。1.2材料及试剂丹参由四川中江丹参基地提供;丹酚酸B 对照品(中国药品生物制品检定所,批号1115622200403,二苯代苦味酰肼自由基(DPPH 、抗坏血酸(A s A 购自Sig ma 公司;二丁基羟基甲苯(BHT 购自上海凌峰化学试剂有限公司(化学纯;大孔吸

11、附树脂D101;乙腈购自汉邦公司,为色谱纯;实验用水为超纯水(18.2M,其余试剂为分析纯。1.3Sal B 的提取和纯化Sal B 的纯化方法在参照文献8的基础上进行。将丹参切片100g,加8倍量水于90水浴加热条件下提取两次,1h /次,合并提取液,高速离心,上清液减压浓缩,定容至100m l 。醋酸乙酯萃取两次,合并萃取液减压蒸干,用适量水溶解后,以4m l/m in 的流速上D101大孔吸附树脂柱,静止吸附2h 。分别用水和20%乙醇洗除去上样液中未吸附成分后,用50%乙醇洗脱,洗脱液减压浓缩除去乙醇,冷冻干燥得Sal B 。1.4DPPH 自由基清除法测定方法基本参照文献9的方法操6

12、042时珍国医国药2006年第17卷第12期L I SH I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2006VOL.17NO.12作,稍作修改。反应体积为3m l,加入0.5m l 不同浓度的样品于6×1025mol/L 的DPPH 乙醇溶液中,用力摇匀,室温下测定DP 2PH 反应液在517n m 处的吸光度。样品对DPPH 的清除率(%=(A 0-A 样/A 0×100。以无水乙醇做空白对照,A 0为DPPH 对照在时间t =0时的吸光值,A 样为加有样品的DPPH t=30m in 时的吸光值。每次测定重

13、复3次。BHT,A s A 分别以无水乙醇配制成不同浓度的溶液,同法测定BHT,A s A 作对照比较。1.5供试样品的配制将Sal B 配制成20mg/m l 的水溶液。所得Sal B 水溶液分别置于60,80,90水浴中加热120m in,取出后迅速以冰水浴冷却,混匀。另将1份Sal B 水溶液以醋酸调pH3,置于90水浴中加热120m in 。每次测定均设3 份平行样。1.6标准曲线的制备用HP LC 测定Sal B 标准溶液。以浓度和对应的峰面积建立线性回归方程为Y =14152X -1009.8(r =0.9999。标样浓度和对应的峰面积在824mg/m l 范围内有很好的线性关系。

14、精密度实验RSD =0.65%;重复性实验RSD =1.2%;加样回收实验的平均回收率为99.2%,RSD =2.8%。SalB 提取物中Sal B 含量由上述回归方程计算而得。1. 7统计分析实验结果的数据用SPSS 统计软件处理,结果表示为平均值±标准偏差。方差分析比较用t 检验,P <0.05时为显著性差异。2结果与讨论2.1提取物中Sal B 含量的测定将Sal B 提取物配制成20mg/m l 的溶液,按设定的色谱条件,进样20m l,测得样品液中Sal B的峰面积。按峰面积值用外标两点法计算其含量(图2。所得提取物中Sal B 的纯度为90.5%。a 2对照品b 2

15、提取物1.丹酚酸B 图2丹酚酸B 的HP LC 色谱图2.2DPPH 浓度-吸光度响应曲线DPPH 自由基清除模型是一种筛选自由基清除剂的简便快速的分析法。DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基,由于其具有单电子而在517n m 处有一强吸收。正常情况下,DPPH 乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时,DPPH 的单电子被配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析。DPPH +AH =A +DPPH 由图3可知,在560mmol/L 范围内DPPH 浓度(X 与517n m 下的吸光度(Y 有良好线性关系,Y =0.0104X +0.0

16、051(r =0.9999。因此,当抗氧化剂存在时,可通过测定DPPH 自由基和其反应后吸光度减弱的程度,来反映试样对自由基的清除情况,从而评价试样的抗氧化能力。图3DPPH 吸光度(517nm 与浓度的关系2.3Sal B 对DPPH 自由基的清除能力不同浓度的Sal B 提取物对DPPH 自由基均有显著的清除作用,5g/m l 的Sal B 对DP 2PH 自由基的清除率为26.3%(表1。随着浓度的增大,清除能力与浓度在一定范围内呈量2效关系。当Sal B 浓度增加到一定程度(大于50g/m l ,其清除能力的增加速度渐缓。在浓度从5g/m l 到200g/m l 的范围内,SalB 提

17、取物对DPPH 的清除能力均高于同浓度下人工抗氧化剂BHT 和A s A 。当Sal B 提取物浓度在100g/m l 以上时,其清除能力与A s A 相接近。从化学结构上看,Sal B 是一种缩酚酸类化合物,由两分子咖啡酸与两分子3,42二羟基苯基乳酸(即丹参素缩合而成。由于Sal B 含有多个游离酚羟基,因此具有很强的提供氢质子的能力,使具有高度氧化性的自由基还原,终止自由基链锁反应,从而达到清除自由基的目的。表1Sal B 提取物清除DPPH 自由基的能力%样品DPPH 清除率5g m l 2120g m l 2150g m l 21100g m l 21200g m l 21Sal B

18、 提取物26.3±0.366.7±0.677.2±0.480.8±0.487.3±0.3A s A 13.2±0.558.1±0.969.5±0.278.3±0.186.3±0.3BHT 10.4±0.528.2±0.345.0±1.655.9±0.264.7±0.1表中数据为平均值±标准偏差,n =3图4是利用Sal B 标准品(纯度是99.3%配制成的溶液所做的清除DPPH 自由基研究结果。与上述Sal B 提取物(纯度90.5%的

19、研究结果(66.7%有所不同,在相同浓度(20g /m l 时Sal B 对DPPH 的清除率为79.5%。可见,Sal B 的纯度越高,其清除能力越强。图4也同时进一步证明了上述随着Sal B 浓度的升高,其清除能力增强的结论。图4Sal B (纯度99.3%浓度与DPPH 自由基清除率的关系2.4加热温度对Sal B 含量和DPPH 自由基清除作用的影响Sal B 提取物的水溶液在高于80温度下加热120m in 后,Sal B 的含量有不同程度的下降,所对应的对DPPH 的清除率也有所降低(表2,尤其是在90下加热,Sal B 的含量和清除能力均有较大幅度地下降(P <0.05。而

20、在80加热120m in 后,虽然Sal B 含量有明显下降(P <0.05,但其清除率只有轻微下降,分析原因可能是Sal B 在高温下发生酯键水解,分解转化为其他酚酸类成分6,7,这些酚酸也参与了对DPPH 自由基的清除,从而使总体抗氧化能力下降不明显。上述结果表明:Sal B 对温度和受热时间敏感。温度越高,Sal B 的含量和抗氧化能力下降越明显。虽然Sal B 对热不稳定,但在90加热120m in 后,其清除率仍有44.4%,显示了SalB 的抗氧化潜力。表2不同加热温度对Sal B 含量和自由基清除能力的影响温度T /加热t /m in Sal B 含量C /mg m l 2

21、1DPPH 清除率(%018.1±0.166.7±0.66012017.9±0.466.4±0.88012014.8±0.465.4±0.99012010.8±0.244.4±2.0表中数据为平均值±标准偏差,n =62.5酸性条件下热处理对Sal B 含量和DPPH 自由基清除作用的影响在pH 3的条件下,Sal B 水溶液对热较为稳定(表3。与表2相比较分析,未调pH 值的SalB 样品溶液在90加热120m in 后,Sal B 的含量由18.1mg/m l 下降到10.8mg/m l,对应的抗氧化

22、活性也降为加热前的66.6%。但在pH 3的环境下,同样的加热温度和时间处理后,Sal B 含量的DPPH 自由基清除活性无明显改变。说明酸性有利于Sal B 的热稳定性及其抗氧化活性的发挥。研究表明,pH 值对DPPH 分析体系的影响较大,在pH210范围内物质的抗氧化活性随pH 值的升高而降低9。本实7042L I S H I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2006VOL.17NO.12时珍国医国药2006年第17卷第12期验中,pH 3时Sal B 的抗氧化能力在加热前后都明显高于未加酸时的Sal B 水溶液,分析原

23、因可能是反应体系中用于调节pH 值的醋酸提供了氢质子,参与了DPPH 的反应体系,使Sal B 的表面清除能力可能增加,有待进一步探讨。表3酸性条件下热处理对Sal B 含量和抗氧化活性的影响( s ±s 加热t /m in Sal B 含量C /mg m l 21DPPH 清除率(%015.5±0.286.2±0.712014.4±0.487.5±0.1n =6;pH =3,加热温度为903结论本文实验表明Sal B 具有较强的清除DPPH 自由基的能力。在相同浓度下其清除能力均高于BHT 和A s A,显示了其作为天然抗氧化剂的潜力,但Sa

24、l B 性质较不稳定,长时间的高温对其含量和抗氧化能力有明显的负面影响。酸性条件有利于丹酚酸B 的稳定性和增加其抗氧化能力。已有实验证实10,11Sal B 在其它不同的自由基生成系统中也有不同程度的抗氧化能力。本文通过Sal B 清除DPPH 有机自由基能力的变化考察了体外环境下温度和pH 值对Sal B 抗氧化能力的影响,对Sal B 在体内生理环境下的稳定性以及对抗氧化作用的影响还有待进一步研究。参考文献:1凌关庭.抗氧化食品与健康M .北京:化学工业出版社,2004:2.2国家药典委员会.中国药典,部S .北京:化学工业出版社,2005:52.3杜冠华,张均田.丹参现代研究概况与进展(

25、续一J .医药导报,2004,23(6:355.4杜冠华,张均田.丹参水溶性有效成分-丹酚酸研究进展J .基础医学与临床,2000,20(5:210.5彭宗根,陈鸿珊.紫草酸B 的药理作用研究进展J .中国药学杂志,2003,38(10:744.6毛声俊,侯世祥,唐昌炯,等.丹参素在加温加速条件下的含量变化规律研究J .中国中药杂志,2003,28(3:220.7张军,王凤云,詹丽玲,等.丹参药材提取液中丹酚酸B 稳定性影响因素的考察J .中国中药杂志,2005,30(10:789.8王凤美,陈军辉,李磊,等.高纯度丹酚酸B 的制备工艺研究J .时珍国医国药,2005,16(6:476.9许申

26、鸿,杭瑚.溶剂及pH 值对1,12二苯基222苦肼基自由基分析法的影响J .分析测试学报,2000,19(3:50.10D ing -You L i,L i -Na Xu,Xiao -Guang L iu .Effects of W ater -s olu 2ble Components Is olated fr om Salvia m ilti orrhiza on Oxygen Free Radi 2cal Generati on and L i p id Per oxidati on J .Journal of Chinese Phar ma 2ceutical Sciences .19

27、95,4(2:106.11Yokoza wa T,Chung HY,Dong E,Oura H.Confir mati on thatmagnesi 2um lithos per mate B has a hydr oxyl radicalscavenging acti onJ .Experi 2mental Toxicol ogy and Pathol ogy .1995,47:341.收稿日期:2006201211;修订日期:2006206225基金项目:广东省中医药管理局科研课题(No .2040020作者简介:黄志海(19732,男(汉族,广东梅县人,现任广东省中医医院副主任药师,学士

28、学位,主要从事中药药剂工作.3通讯作者简介:蔡宇(19722,男(满族,辽宁沈阳人,现任暨南大学药学院副教授,博士学位,主要从事中药药理工作.何首乌水煎液膜分离不同药效部位对造血系统影响的研究黄志海1,蔡宇23,余绍蕾2(1.广东省中医医院,广东广州510120;2.暨南大学药学院,广东广州510632摘要:目的分离何首乌水提液的不同药效部位,评价其对造血功能的影响。方法用陶瓷微滤膜分离何首乌水煎液药效部位,取膜分离所得上清液作受试液A,何首乌水煎液(受试液B 作阳性对照;采用环磷酰胺诱发造血功能障碍动物模型,将动物分为6组,即空白对照组、模型对照组、受试液A 高(250mg/kg 、中(12

29、5mg/kg 、低(65mg/kg 剂量组和受试液B (125mg/kg 组,从外周血象变化、红系祖细胞(BF U -E 和粒单细胞集落形成细胞(CF U -G M 角度评价其对造血功能的影响。结果何首乌水煎液和膜分离所得上清液对造血障碍动物外周血象、红系祖细胞(BF U -E 均有不同程度的改善。结论何首乌膜分离所得上清液有改善动物造血功能障碍的作用,其改善造血功能的作用优于水煎液。关键词:何首乌;膜分离;造血中图分类号:R285.5文献标识码:A 文章编号:100820805(20061222408202Study of D i fferen t Effecti ve Porti on o

30、f Ceram i c M em brane -separa ted W a ter -extract of R ad ix Po lygon i M u ltiflo ri and its Acti on on Hema topo i eti c SystemHUANG Z hi 2hai 1,CA I Y u 23,Y U S hao -lei 2(1.Guangdong Hospital of Trad itiona l ChineseM edicine,510120,China;2.College of Phar m acy,J inan U niver 2sity,Guangzhou

31、 510632,China Abstract O bjecti ve To separate different effective porti on fr om water -extract of Radix Polygoni M ultiflori and study its effect on he mat opoiesis .M ethods U se cera m ic me mbrane t o separate effective porti on fr om water -extract of Radix PolygoniM ultiflori .U se above clear liquid obtained by cera m ic me mbrane -separated as A and water -extract of Radix PolygoniM ultiflor i (B as a contr o