第八章节动物遗传操作

1、2022-2-1 2动物遗传学动物遗传学动物遗传学动物遗传学主讲教师：主讲教师：刘若余联系电话13984812913第八章第八章 动物遗传操作动物遗传操作Chapter 8 Genetic Manipulation 第一节第一节 概述概述什么是动物遗传操作？它有哪些优势？n动物遗传操作是在分子和细胞水平上对动物的遗传结构进行定向修饰和重组的技术总称，包括个体、细胞和分子水平上的遗传重组与修饰。n一方面，可将携带有不同优良性状基因的动物个体通过杂交的方式产生后代，由于后代优良性状基因互补产生杂种优势（heterosis, hybrid vigor），显著提高生产性能；

2、另一方面，通过细胞和分子水平上遗传修饰，迅速改变动物个体的遗传特性，并在一定程度上实现动物的定向遗传改良，培育出抗逆、耐粗、优良的动物新品种。二、动物遗传操作的技术途径二、动物遗传操作的技术途径（一） 人工受精（artificial insemination）在动物个体水平上集成不同种群优良基因。意义：可克服地域隔离、种群个体大小差异难以交配等问题，且能迅速增加某一优良基因在种群中的基因频率，广泛应用于动物的品种改良与新品种培育。（二） 胚胎移植（embryo transplantation） 将胚胎从一头母畜的子宫内取出，移植到另一头生理状态相同的同种母畜子宫内，使之继续发育成为新个体的一种

3、技术。意义：可利用普通的动物种群繁殖高生产性能的优良动物种群，加快动物育种的进程。目前，在提高奶牛群体的产奶性能、推动我国奶业的发展等方面发挥重要作用。 （三）胚胎嵌合（embryonic chimera） 在胚胎发育的早期阶段，将两枚或以上不同遗传特性的胚胎卵裂球分离，重新组合形成一枚具有不同遗传背景的新胚胎，进而产生不同遗传特性组合的新个体。意义：打破了物种间的生殖隔离，将不同物种的遗传特性聚合在一起，获得新的育种材料。n嵌合体的动物最早出现在希腊神话中，它是“山羊”，它拥有羊身、狮头和蛇尾，会喷火的一种怪物。现代的克隆技术中，也有一种叫胚胎嵌合的技术。（四）细胞核移植（nuclear t

4、ransfer）将一个供体细胞的细胞核移植到一枚去核的受体卵母细胞内，使之重构形成胚胎，进而发育成为动物个体的一种技术。意义：可实现动物细胞核质的杂交，使动物能够通过无性繁殖的方式产生后代，进而使得高产动物的优良性状得以稳定遗传，快速扩殖高产的动物群体（五）转基因技术（gene transfer）在分子水平上对动物的基因组进行遗传修饰，通过向动物基因组中导入新的基因，或者对动物基因组中的特定基因进行修饰，进而获得具有特定遗传性状的动物育种新材料。意义：可打破不同生物物种间的生殖间隔，将外源基因直接导入动物个体中，是动物遗传操作最为快捷的技术途径。n法国分子内分泌学家Seralini及其同事在2

5、009年第7期国际生物科学学报上发表文章，讨论给老鼠喂食三种孟山都（Monsanto）公司转基因玉米的实验和分析结论。文中指出，老鼠在食用转基因玉米三个月后，其肝脏、肾脏和心脏功能均受到一定程度的不良影响n2010年4月16日，俄罗斯广播电台俄罗斯之声以俄罗斯宣称转基因食品是有害的为题报道了一则新闻，该新闻称，由全国基因安全协会和生态与环境问题研究所联合进行的试验证明，转基因生物对哺乳动物是有害的；负责该试验的Alexei Surov博士介绍说，用转基因大豆喂养的仓鼠第二代成长和性成熟缓慢，第三代失去生育能力。俄罗斯之声还称“俄罗斯科学家的结果与法国、澳大利亚的科学家结果一致。当科学家证明转基

6、因玉米是有害的，法国立即禁止了其生产和销售”。第二节第二节 细胞遗传操作细胞遗传操作 一、细胞的建系培养一、细胞的建系培养n细胞培养（cell culture）是将动物组织或细胞从机体取出后分散成单个细胞，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长与增殖的技术 。可分为原代细胞和传代细胞。n体细胞建系培养体细胞建系培养 n胚胎干细胞建系培养胚胎干细胞建系培养 n原生殖多能干细胞建系培养原生殖多能干细胞建系培养 n精原干细胞精原干细胞 (一一) 体细胞建系培养体细胞建系培养1. 取材n取材是动物原代细胞培养成功的关键步骤，若取材不当，会直接影响细胞的体外培养效果。 2.原代培养（primary cul

7、ture）n将动物特定组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞或小的组织块，置于合适的培养基和培养环境中，使细胞得以生存生长和增长，这一过程称原代培养。n（1）消化培养法（2）组织块培养法3.传代培养（passage）n随着原代培养的细胞增值，单层培养的细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖，这时需要进行消化、传代培养，否则细胞会因为接触抑制而影响生长。细胞由原代培养瓶内消化，并按一定比例稀释后转移到新的培养瓶进行培养的过程为传代培养。4.细胞系的维持n细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冷冻保存实现的。需要注意记录完整的细胞系

8、档案，如组织来源、培养液条件、传代换液规律、细胞的遗传学标志等等。 （二）胚胎干细胞建系培养（二）胚胎干细胞建系培养n胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES细胞）是从早期胚胎卵裂球或囊胚内细胞团（ICM）分离培养获得的，能在体外培养的一种高度未分化多能细胞。nES细胞的生物学特性（1）全能性和多能性n全能性（totipotenty）：ES细胞具有发育成完整动物个体的能力。n多能性（pluripotency）：ES细胞具有发育为多种组织的能力。（2）ES细胞的体外增值特性（3）ES细胞的可操作性（4）ES细胞的形态特性：细胞核大，胞质少，体外培养时细胞排列紧密，程集落状生长，

9、形似鸟巢，边缘折光性强。（三）原生殖多能干细胞建系培养（三）原生殖多能干细胞建系培养n原生殖多能干细胞 (primordial germ cell，PGC)是指性腺原始生殖细胞经分离培养后得到的一类具有多能性的细胞。1.原生殖多能干细胞的分离方法 2.原生殖多能干细胞的传代方法 （四）精原干细胞（四）精原干细胞n精原干细胞（spermatogonial stem cell， SSC）是睾丸曲细精管生精上皮内可复制的多潜能双倍体细胞，并始终保持着干细胞的原始状态直到青春期。精原干细胞是雄性动物中唯一可以自我增殖、更新并向下一代传递遗传信息的细胞类型。对精原干细胞的操作和修饰在建立转基因动物模型、

10、制备乳腺生物反应器等方面有重要意义。n动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。（2）易分离提纯，成本低廉。现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层

11、析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。（3）产量高。外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。 二、基因打靶（二、基因打靶（gene targeting）1.定义n应用同源重组原理将外源DNA定点整合到宿主细胞基因组，替代靶序列整合在预定的基因位点，从而改变细胞甚至生物个体遗传特性的遗传操作方法。2.意义n利用基因打靶，可以将某个基因敲除（gene knockout），使之失去功能，继而通过表型分析研究该基因编码的特异蛋白的功能，诠释基因功能，是功能基因

12、组学研究的有力工具。n可以通过将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。还可以将某些药物用蛋白基因定点敲入高等生物基因组中的高表达基因座，获得高效的生物反应器。n基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。 三、细胞的转染与筛选三、细胞的转染与筛选n细胞转染（cell transfection）是指外源基因导入真核细胞的过程 。n根据不同的实验目的，外源DNA导入哺乳动物细胞有两

13、种类型：瞬时转染和稳定转染。n瞬时转染：外源基因进入受体细胞后，并未整合到细胞的染色体，而是应用宿主细胞的表达系统瞬时表达外源基因，一般在基因导入细胞14d后收获细胞进行目的基因表达分析，外源基因DNA在宿主细胞内会逐步降解。n稳定转染：需要外源基因整合到宿主细胞的染色体上，从而得到稳定的转染细胞株，达到长期表达外源基因的目的。Human gene therapy 人的基因治疗人的基因治疗 （一）细胞的转染方法（一）细胞的转染方法1、磷酸钙法2、阳离子脂质体法n转染效率高，细胞毒性低，操作简单，能把DNA和RNA转染到各种类型的细胞，没有免疫原性，是目前常用的动物细胞转染方法。脂质体法转染效率

14、受脂质体成分、细胞种类及实验条件等诸多因素的影响。3、逆转录病毒介导法n目前应用最广泛也是效率最高的外源基因转运系统，但由于其可能存在的遗传毒性、免疫原性及难于像质粒那样大规模制备重组病毒而限制了应用。4、电穿孔法（electroporation）n理论上讲电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。因为细胞的死亡率高，此法每次转染需要更多的细胞和DNA。n每种转染方法都有其局限性和适用范围，不存在适合于所有细胞的转染方法。 （二）阳性细胞的筛选方法（二）阳性细胞的筛选方法1.阳性细胞的筛选策略n目前常用的筛选策略有正负筛选法（postive-negative sel

15、ection，PNS）和正向选择法（无启动子筛选法，无PolyA筛选法）两类。2.阳性单克隆的筛选方法（三）阳性细胞的分子遗传鉴定（三）阳性细胞的分子遗传鉴定n筛选得到抗性细胞克隆，表现出对G418的抗性和对GANC的耐受性，但此时目的基因是否发生了定点整合，仍需做进一步的分子水平鉴定。中靶细胞的鉴定常采用PCR和Southern杂交分析的方法。PCR方法以快速、操作简便的特点而广泛适用于对大量样品的快速鉴定，是一种比较理想的粗筛方法。其引物设计的特点是一条位于打靶载体的正选择标记基因内，另一条位于同源短臂序列以外的旁侧片段上。用PCR法筛选鉴定时，有时会出现假阳性结果，原因可能是参入了其他细

16、胞克隆或PCR鉴定载体，所以应采用Southern杂交作进一步的分析。第三节第三节 动物克隆动物克隆n什么是动物克隆？n指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传背景后代的过程，包括孤雌激活生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割以及核移植等。n通常，将所有非受精方式繁殖所获得的动物均称为克隆动物，将产生克隆动物的方法称之为克隆技术。n动物克隆的意义有哪些？1.能使遗传性状优秀的个体大量增殖，大大加快动物育种进展；2.可用来扩大转基因动物的后代数量，提高生产转基因动物的效率；3.通过胚胎性别鉴定，再克隆，可生产出大量预知性别的动物后代对于性别控制具有重要实践意义；4.可用于珍稀和濒危动物的

17、扩繁和保种5.满足生物医学研究对实验动物的特殊需要，提高实验的准确性。n此外，以此技术为基础，可以研究许多极为重要的基础问题，如动物个体发生的核质互作关系、细胞核的去分化和重新编程问题以及重构胚的线粒体变化、细胞的老化等问题动物克隆研究的历史和现状动物克隆研究的历史和现状n我国哺乳动物克隆研究虽起步较晚，但近年来也取得了长足进展。n1990年杜淼克隆出我国首例克隆动物家兔。n胚胎细胞的克隆山羊、牛和猪已分别于1991，1995和1996年研究成功。n山羊继带克隆的研究也已于1993年取得成功。n近年来，体细胞克隆技术也在我国发展很快，体细胞克隆山羊和克隆牛分别于2000年和2001年研究成功，

18、2004年11月和2005年3月又分别克隆成功世界首例胎儿体细胞克隆水牛和成年体细胞克隆水牛。 “多莉多莉”诞生十年，世界克隆进展诞生十年，世界克隆进展n1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利” 诞生n1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。n1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。n 一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠n2000年 曾参与克隆“多利” 羊的英国公司培育了第一n 批克隆猪 n2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。n2002年 法国研究人员克隆出兔子。n2003年 美国科学家推出了一匹克隆骡。n 爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的

19、爪哇 野牛。n2004年 美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一只克隆猫。这只猫后来成为第一只被卖出的克隆宠物。n2005年 韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内。科学家共培育277个胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降临人世。直到1997年2月23日才公布于众。首条克隆狗叫首条克隆狗叫“斯纳皮斯纳皮” 二、动物克隆的方法二、动物克隆的方法n细胞核移植的基本操作程序包括MII期（第二次减数分裂中期）卵母细胞的去核、供体细胞的准备、细胞

20、周期的调控、细胞融合、卵母细胞激活和重构胚的培养等，其中的每一个环节对核移植的效果都有影响。n（一）供体细胞的准备n（二）受体细胞的准备n（三）注核n（四）供体细胞与受体卵母细胞的融合n（五）重构胚的激活n（六）重构胚的培养n（七）继代细胞核移植 （一）供体细胞的准备（一）供体细胞的准备n作为核供体的细胞可以是胚胎细胞，也可以是ES细胞或ES样细胞、胎儿成纤维细胞、未分化的PGC或高度分化的成年动物体细胞。n供体核的种类和发育阶段的不同，其核移植的效果仍存在着很大差异。1.胚胎作为核供体n哺乳动物胚胎细胞核移植实验证实，从2细胞期到内细胞团的胚胎细胞都具有发育的全能性，都可以作为供体细胞。然而

21、供体细胞的胚龄和类型对核移植结果有时产生一定的影响。n供体细胞和受体细胞所处的细胞周期阶段对核移植胚胎的发育（率）也有重要影响。2.体细胞作为核供体n1997年，“多莉”的成功诞生表明成年哺乳动物的体细胞不仅具有基因组的全能性，而且还能在卵母细胞质中回复到发育的起始状态，完成整个个体发生过程。n用体细胞作为核供体进行核移植时，亦须对其细胞周期进行调控。调控供体细胞周期最为常用的方法是血清饥饿法。另一种方法是用Aphidicolin（APD）培养处理供体细胞。nAPD，一种哺乳动物DNA聚合酶的可逆性抑制剂，可将细胞周期阻抑在G1到S期的过渡阶段。n不同种类的体细胞，其核移植效果存在着明显差异。

22、目前普遍认为，颗粒细胞的核移植效果最好。3.胚胎干细胞作为核供体nES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。nES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需要进行细胞周期的调控。n供体细胞一般为活的细胞，但供体细胞也可以通过冻干保存，使得供体细胞的保存运输更为简单方便。 （二）受体卵母细胞的准备（二）受体卵母细胞的准备n受体卵母细胞在核移植前需进行去核。如果不去核或去核不完全的话，将会因重组胚染色体的非整倍性和多倍体而导致发育受阻和胚胎早期死亡。因此，去核方法极为重要，目前常用的去核方法有如下几种。1.盲吸法n由于第一极体刚排除或排除后不久

23、，染色体就在极体的附近，因此，用显微去核针吸取极体附近的部分细胞质便可去掉细胞核。2.半卵法n将卵母细胞切为两半，去掉含有极体的一半，然后用不含极体的一半进行核移植。3.荧光引导去核法n先用Hoechst33342对卵母细胞1015分min，然后，在荧光n显微镜下确定核的位置，去核后再观察吸去的细胞质或去核后的卵母细胞是否含有细胞核，以保证去核成功率。4.微分干涉和极性显微镜去核法n对于一些脂肪颗粒含量较少的卵母细胞（如兔和小鼠等），在微分干涉相差显微镜下可观察到染色体，因此，对于这类卵细胞可直接在微分干涉相差显微镜下去核。5.功能性去核n将卵母细胞浸泡在Hoechst33342 DNA染色液

24、中，然后用紫外线照射核区，从而使核丧失功能。6.离心去核法n根据细胞核与细胞质的密度不同，细胞核的密度大于细胞质，用离心的方法可使没有透明带的卵母细胞核被甩向一侧而最后脱离卵母细胞。7.化学试剂去核法n用Etoposkle和放射菌酮处理于第一次减数分裂中期的小鼠卵母细胞，处理后的染色体相互紧密结合不易分开，形成染色体复合体，在卵母细胞排出极体时，染色体复合体随极体一起排出这样可使卵母细胞去核成功率达90%。8.末期去核法n以上几种去核方法的前四种比较常用，特别是第三种方法目前应用最广，而第五种方法紫外线照射可能影响卵母细胞质的功能，进而影响核移植效率，故一般不予采用。 （三）注核（三）注核n去

25、核卵母细胞经恢复就可作为核移植的受体接受核供体移入。按核供体移入部位的不同，即带下移植（注射）和细胞质内注射。 （四）供体细胞与受体卵母细胞的融合（四）供体细胞与受体卵母细胞的融合n带下注核的卵母细胞必须对其进行融合处理才能使供核细胞与受体卵母细胞形成卵核复合体。目前，细胞融合的方法主要有3种，即化学、仙台病毒和电融合法。n用化学方法进行细胞融合时对细胞有毒性作用，且需去掉透明带，故很少应用于细胞核移植技术。使用仙台病毒融合法，对胚胎发育有影响，易发生污染且对牛等动物无效，亦故很少用。n电融合法是目前动物核移植的最佳融合方法，因其不仅可使供体细胞与受体卵母细胞的质膜有效融合，还可引起卵母细胞的

26、激活。原理是依靠直流脉冲使细胞膜产生可逆性的微孔进而导致他们之间的融合。 （五）重构胚的激活（五）重构胚的激活n核移胚的正常发育有赖于卵母细胞的充分激活，低的核移胚发育率可能与卵母细胞未充分激活有关。n通过近年来的大量研究，下列4种方法均能有效地激活各个成熟阶段的卵母细胞：钙离子载体结合电激、放线菌酮和细胞松弛素处理。乙醇结合放线菌酮和细胞松弛素处理。离子霉素或钙离子载体结合二甲氨基嘌呤（6-DMAP）处理。电激活结合三磷酸肌醇与6-DMAP处理。 （六）重构胚的培养（六）重构胚的培养n经融合和激活后的重构胚，其培养方法主要有体内和体外培养两种。体内培养就是在细胞核质融合后，以琼脂包埋，移入暂

27、时的中间受体的输卵管内，培养45d，然后回收胚胎进行移植。这种方法操作较为复杂，成本高，不利于商业性核移植。因此，人们一般采用体外培养方法。 （七）继代细胞核移植（七）继代细胞核移植n继代细胞核移植又叫连续细胞核移植（serial nuclear transfer），即将核移植胚胎的卵裂球分开，作为供核细胞，再进行连续多代的核移植，以便从一枚胚胎得到更多的克隆胚胎。 三、影响动物克隆效率的因素三、影响动物克隆效率的因素（一）受体卵母细胞的选择（一）受体卵母细胞的选择（二）供体细胞的细胞周期（二）供体细胞的细胞周期（三）核质同步性对重构胚发育的影响（三）核质同步性对重构胚发育的影响 （一）受体卵

28、母细胞的选择（一）受体卵母细胞的选择n要通过细胞核移植技术成功克隆哺乳动物，受体细胞的质量尤为重要。目前，用于核移植的受体细胞主要有分裂间期受精卵和MII期的卵母细胞，其中以后者最为常用。 （二）供体细胞的细胞周期（二）供体细胞的细胞周期n细胞周期是由间期和分裂期（M期）组成，其中间期又分为G1、S、G2期。G1期为DNA的准备阶段，S期为DNA合成期，G2期是S期向分裂期过渡阶段。n控制供核细胞周期的长度及其在细胞周期中的位置是必须的。1.胚胎细胞核n哺乳动物大部分胚胎细胞均处于S期，这一方面是由于随着受精卵的分裂，早期胚胎细胞体积逐渐减小，细胞生长受透明带的限制，另一方面是由于母源性转录产

29、物和细胞成分使早期胚胎不需要合成供自身发育的物质，所以G1期缺乏或很短，而胚胎细胞能够集中进行染色体复制与分裂。因此随机利用胚胎细胞作为核移植的供体核时，供体核大多处于S期。2.体细胞核n利用体细胞作为供体核时，体细胞的细胞周期相对来说比较恒定。选用某一特定类型的细胞即可达到细胞周期同步化的目的。n然而，作为核供体的胚胎或体细胞，其基因组转录激活的时间是核移植研究应考虑的重要因素。（三）核质同步性对重构胚发育的影响（三）核质同步性对重构胚发育的影响n在融合后的重构胚中，核供体与受体细胞质间的相互作用，对其融合后的正常发育起着决定性的作用。n细胞核移植重组胚的DNA合成，既受供体核周期阶段的影响

30、，又受受体胞质周期阶段的影响。n总之，细胞周期阶段对细胞核移植胚胎的发育和染色体组成、结构有很大影响，一般以未激活去核卵母细胞为受体时，以G1期核做供体为宜。当供体核细胞周期不同步化时，应采用激活后的去核卵母细胞为受体。可见，在进行细胞核移植时应考虑供受体细胞周期阶段的相互协调性。 四、动物克隆技术存在的问题及前四、动物克隆技术存在的问题及前景景（一）动物克隆技术存在的问题（一）动物克隆技术存在的问题（二）动物克隆技术广阔的前景（二）动物克隆技术广阔的前景 （一）动物克隆技术存在的问题（一）动物克隆技术存在的问题1.核移植技术存在的主要问题是总效率太低，一般仅为1%6%2.克隆动物出生的体重异

31、常偏大而造成难产的现象也很突出。3.由于培养基中血清的存在，导致早期胚胎基因表达发生改变，致使许多克隆动物出生重增加，很难自然分娩，大多数需要人工帮助。4.克隆动物出生后死亡，畸形等不良后果，使核移植的总体效率大幅度下降。 （二）动物克隆技术广阔的前景（二）动物克隆技术广阔的前景1.扩大优良畜种或稀有动物的数量2.生产转基因动物3.加深核质互作关系的研究4.肿瘤和癌细胞基因活动研究 五、关于克隆人的伦理道德观念问五、关于克隆人的伦理道德观念问题题克隆技术对畜牧业生产、珍稀动物保护及人类的健康等有十分重要的价值，我国支持动物克隆的研究与开发，但坚决反对克隆人。第四节第四节 转基因动物转基因动物一

32、、概述一、概述二、转基因动物的制作方法二、转基因动物的制作方法三、转基因动物的研究现状及应用前景三、转基因动物的研究现状及应用前景 一、概述一、概述n转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的动物，将外源基因导入动物基因组的技术称为转基因技术。n转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。它结合了细胞生物学、基因工程和胚胎工程等相关技术，被公认为是遗传学研究中继21世纪初的连锁分析、20C世纪60年代的体细胞遗传和20世纪70年代的基因克隆之后的第四代遗传操作技术。 二、转基因动物的制作方法二、

33、转基因动物的制作方法（一）原核期胚胎的显微注射（一）原核期胚胎的显微注射（二）精子载体法（二）精子载体法（三）逆转率病毒感染动物早期胚胎（三）逆转率病毒感染动物早期胚胎（四）胚胎干细胞介导法（四）胚胎干细胞介导法（五）转基因克隆动物技术（五）转基因克隆动物技术 （一）原核期胚胎的显微注射（一）原核期胚胎的显微注射n目前最常用的转基因动物生产方法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。此方法目前应用较普遍，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。这种方法的特点是外源基因的导入整合效

34、率较高，不需要载体不需要载体不需要载体不需要载体，直接转移直接转移直接转移直接转移目的基因目的基因目的基因目的基因。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死 （二）精子载体法（二）精子载体法n把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1/10。其次，由于它

35、不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。 （三）逆转率病毒感染动物早期胚胎（三）逆转率病毒感染动物早期胚胎n将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。n 这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。n缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。 （四）胚胎干细胞介导法（四）胚胎干细胞介导法n是将基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作为一种载体，导