PCR_DGGE技术及其在动物肠道微生态学研究中的应用

1、 黄俊文1,2*,冯定远2,林映才1(1.广东省农业科学院畜牧研究所,广东广州510640;2.华南农业大学,广东广州510642PCR-DGGE 技术及其在动物肠道微生态学研究中的应用收稿日期:2004-09-11;修回日期:2005-04-25作者简介:黄俊文(1974-,男,博士,助研*通讯作者自然界的微生物群落是一个复杂而多样的生物群体,仅动物体内的微生物类别就超过400种1。相当长的时间里,人们对微生物的认识主要依赖于传统的微生物鉴定技术。由于微生物形态过于简单,缺乏明显的外部特征,人们对大多数微生物种类的了解仍停留在初级阶段。把可培养细菌的比例与来自不同环境细菌的总量相对比,二者存

2、在相当大的差距,是因为不同生物体间生存的相互依存性。由于传统技术在培养过程中将微生物置于或多或少偏离它们原有小环境的、新的人为操纵的条件下,极可能会改变相关微生物群落原有结构2。研究表明,动物肠道中只有约占总数30%的细菌可以通过常规微生物学的试验方法培养出来,用传统的微生物技术认识微生物生态系统面临着越来越大的障碍。已经知道,rRNA 分子在生物进化过程中始终保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区和可变区,研究rRNA 基因序列可以发现各物种间的系统发生关系,其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16S rRNA 长约1540bp

3、,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。近年来,以16S rRNA 基因为基础而建立的分子生物学技术正逐步广泛用于环境微生物群落的分析。这些分子技术主要有:16S rDNA 基因序列分析、RAPD (随机扩增多态性DNA、核酸探针检测技术、荧光原位杂交技术、TGGE(温度梯度凝胶电泳以及DGGE(变性梯度凝胶电泳等。本文主要介绍PCR-DGGE 的原理、技术步骤及应用,并就其在动物肠道微生态研究中的应用进行分析。1DGGE 的基本原理DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis ,变性梯度凝胶电泳是一种电泳系统,利用序列不同的DNA

4、 片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA 分开。当双链DNA 分子在变性凝胶中进行电泳,其解链的速度和程度与其序列密切相关,相同碱基对数目的双链DNA 分子由于碱基对组成的不同,解链所需要的变性剂浓度也不同,当某一双链DNA 序列迁移到变性凝胶的一定位置,并达到其解链温度时,即开始部分解链,解链程度越大,迁移阻力越大,DNA 分子的迁移速度随之减小,产生的迁移阻力与电场力相平衡时,具有不同序列的DNA 片段则停留于凝胶的不同位置,形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细,最低可检测到只有一个碱基差异的DNA 片段。自Muyzer 等3首次将DGGE 用

5、于分析土壤环境的微生物区系以来,DGGE 已成为检测环境微生物群落多态性的可靠方法,近年来也开始用于肠道微生态的研究4,5。根据细菌16S rRNA 基因序列中可变区的碱基顺序相差较大,选择与可变区(如V3或V6V8区配对的引物,扩增出细菌16S rRNA 基因的部分序列,并通过DGGE 得到分离,电泳条带的数目、位置和强度可反映样品中微生物的种类及细菌的相对构成比例,反映样本的微生物结构及组成。2PCR-DGGE 的技术步骤对微生物群落的分析常包括3个步骤:提取核酸、摘要:本文综述了PCR -变性梯度凝胶电泳技术(PCR -DGGE分析微生物多态性的原理,介绍其特点和技术步骤,并列举了DGG

6、E 技术在微生态学研究中的应用实例,说明PCR -DGGE 方法作为研究动物肠道微生态系统的新方法,将会发挥更大的作用。关键词:畜牧学;动物肠道微生态;综述;变性梯度凝胶电泳;原理;应用中图分类号:S811.6文献标识码:A文章编号:0258-7033(200617-0047-0447DNA片段扩增和通过遗传指纹技术即DGGE图谱来分析PCR产物。分析指标有:Shannon's多样性参数,可对样品进行多样性分析,公式如下:H'=-Si=1!Piln Pi其中S为每个泳道的条带数,Pi 为每个条带强度占总条带强度的比例,该值越大,说明样品的多样性程度越高,即样品中的微生物种类越多

7、,微生物总的数量较高。Sorenson's pairwise similarity coefficient(Cs相似性分析指数,可比较不同样品间及分析菌群的动态变化,计算公式如下:Cs=2jNx+Ny其中Nx为泳道x条带数,Ny为泳道y的条带数同,j为2个泳道共有的条带数。Cs值越大,表示两个样品的相似程度越高。图1DGGE方法工作流程的示意图3PCR-DGGE技术在肠道微生态学中的应用PCR-DGGE技术已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究,包括沙丘、土壤、水、植物根系等,但对动物肠道微生态变化的研究工作还不太多。目前在人类肠道微生态学研究领域有一些进展,如对粪便中乳酸杆菌种类的分

8、析6,7;新生儿肠道菌的连续变化情况8;服用不同食物(如药物、益生素等后肠道菌群的变化9等,而对动物肠道微生态进行PCR-DGGE分析的研究则更少。3.1肠道菌群多样性分析动物在进食食物或补充药物时,其肠道内的微生物区系会发生明显变化,以前多采用培养方法来测定各个菌种的数量变化,PCR-DGGE技术已经显示出它的优势。Simpson等4分析了DGGE技术在研究猪肠道微生物区系方面的应用条件,并研究猪的年龄、饲粮发生改变时不同个体肠道和粪样细菌群体组成结构变化,表明猪断奶前、断奶后及育肥期肠道内的微生态系统中既有相同菌种,也有不同菌种,而断奶使肠道微生态发生较大变化。Mc-Cracken等5给C

9、57BL/6NHsd鼠饲喂低残留饲粮或口服广谱抗生素(Cefoxitin:25mg/kg,用PCR-DGGE技术监测其粪便菌群变化,发现服用Cefoxitin不会影响粪便微生物多样性(条数与亮度,但用Sorenson's配对相似性系数(Cs测量不同个体的相同菌种则发现无论采食哪种饲粮,Cefoxitin改变了粪便中的菌群结构。而且采食低残留饲粮小鼠的粪便菌群均匀度较高。Tan-nock等9的研究也表明PCR-DGGE能较好地用于人类粪便中专性厌氧菌的数量变化监测。将DGGE与种特异性引物相结合,可从“种”水平上监测鼠胃中乳酸杆菌的存在7,并检测到人肠道中较低数量级的乳酸杆菌10。Wal

10、ter等7对4个人粪样提取DNA,并用特异性引物(lac1,lac2GC进行PCR-DGGE,结果与细菌培养法的结果相比较,表明这对引物可以用于分离不同的DNA片断,且DGGE法能监测到其中2位试者粪中L.rhamnosus的存在,而培养法仅测到一个,说明DGGE法能更好地监测肠道微生物菌群状态和更替。Zoetendal等11对人类粪与活组织样本的DGGE分析表明不同个体间图谱的多样性存在很大的不同:除有病个体外,不同健康个体结肠各部位活组织样本的优势菌落具相似性,但粪便图谱与组织样本差异很大,说明粪便与结肠的肠黏膜菌群结构存在较大差异。朱伟云等12采用PCR-DGGE技术研究仔猪断奶前及断奶

11、后其粪样中微生物区系的组成,分析仔猪个体、日粮对其粪样细菌群体组成的影响。对DGGE图谱中条带数量及位置的分析表明,当仔猪哺乳时,母猪对其哺乳仔猪体内的优势菌群有一定的影响,而断奶后仔猪体内已形成各自特征性的菌群,母体来源和日粮对其粪样细菌群体组成没有显著的影响。3.2菌落动态性变化人类或动物在进食某类食物(牛奶或饲料时,其肠道内的微生物区系会随着时间的变化发生变化,通过传统的培养法连续取样监测虽然能了解到主要的微生物变化(如乳酸杆菌、双歧杆菌等,不仅不能研究微生态的完整动态变化,而且工作量很大。PCR-DGGE则能有效地监测整个系统的微生物区系变化。Favier等8用DGGE法分析婴儿粪便微

12、生物组成,发现随时间推移,婴儿样品的DGGE图谱越来越与其亲属的样品图谱相似,表明了饮食、环境和遗传因素影响了人体肠道微生物组成。Simpson等4对1头5 月龄48 猪消化道各部分内容物及黏膜样本进行PCR-DGGE 分析,除盲肠外,同一结构部位的内容物与黏膜处的条带模式彼此近似,但肠道不同部位则表现出明显不同,取样部位相距越远,配对相似指数(Cs越小,结果说明不同年龄猪粪便中既有共同菌类分布,也具有独特的细菌群,且不同部位肠道菌群分布有差异,解剖结构相距越远,菌群相似性较小。朱伟云等12分析了仔猪断奶后2周内其粪样的DGGE图谱,表明各组仔猪在断奶当天的一些优势条带在断奶后第6天时消失,多

13、数条带在第13天时消失,而新的条带在第6天、第7天或第13天陆续出现;相似性分析表明,在断奶后13d 内,DGGE图谱变化迅速,在断奶第67天样本DGGE 间的相似值最高。对采食含寡果糖及甜菜汁饲料的仔猪,断奶当天仔猪粪样DGGE图谱与对照相似,但与其他时间粪样的相似值低于20%,t检验分析表明,组间存在显著差异。虽然第16天的时间比第613天的短,但是前两者的相似值比后两者间的显著要低。说明仔猪断奶后细菌群体在断奶第1周内先急剧变化,而后缓慢。分析认为与日粮中含有的寡果糖有关,因为寡果糖被认为能调控动物肠道微生物区系。4PCR-DGGE技术存在的不足除了微生物生态学中大多数分子生物学技术所面

14、临的一般性可能的偏见外,DGGE也有其限制性:只能分离较小的片段(最长只达1000bp,这些序列只能提供有限的信息,片段太长时解离率下降,限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。分辨率,DGGE 通常显示群落中优势种类的DNA片段,1%左右的细菌种群可通过PCR-DGGE检测到13。Yang等14在研究与根不同部位相关的根际微生物群落结构中发现,产生于根的所有部位得到的单条16S rDNA带的克隆的序列分析揭示同一条带中有不同的种类,表明DGGE在种水平上鉴定细菌群落结构是有限的。依据16S rDNA的DGGE研究群落多样性,由于某些种类16S rDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分

15、子的检出可能会导致自然群落中细菌数量的过多估计15。5研究展望动物肠道微生物的菌群结构及含量受到包括进食不同食物在内的各种因素的影响,正常肠道菌群能够提高生长速度,改善产品质量,并有助于减少疾病。传统的培养法只能对有限的几种已知微生物进行评估,无法认清样本的全貌。PCR-DGGE技术虽然还存在一些不足,但是,可以通过和其他一些方法如传统培养、微生物对糖发酵的产物分析、杂交技术以及测序技术等相配合,从而更全面的认识微生态的组成和动态变化。总之,PCR-DGGE法无需培养计数,通过对DGGE 图谱进行多样性分析,就能监测到样品中的菌种组成和优势菌种,操作简单快捷,所以说PCR-DGGE作为研究动物

16、肠道微生态系统的新方法,必将得到更广泛的应用。参考文献:1Drasar B S,Roberts A K.Control of large bowel microflora InHuman Microbiology Ecology(Hill,M.J.R.&Marsh,P.D.,edsM.Boca Raton,FL:CRC Press Inc,1990.95-100.2Dunbar J,White S,Forney L.Genetic diversity through the lookingglass:effect of enrichment biasJ.Appl Environ Mic

17、robiol,1997,(63: 1326-1330.3Muyzer G,Waal E C,Uttrlinden A G.Profiling of complex microbialpopulations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for16S rRNAJ.Appl Environ Microbiol,1993,(593:695-700.4Simpson J M,McCracken V J,White B A,et

18、 al.Application ofdenaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiotaJ.J Microbiol Meth,1999,36:167-179. 5McCracken V J,Simpson J M,Mackie R I,et al.Molecularecological analysis of dietary and antibiotic-induced alterations of the mouse intestinal micr

19、obiotaJ.J Nutr,2000,131:1862-1870. 6Walter J,Tannock G W,Tilsala-Timisjarvi A,et al.Detection andidentification of gastrointestinal lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primersJ.Appl Environ Microbiol,2000,66:1297-303.7Walter J,Hertel C,Tann

20、ock G W,et al.Detection of Lactobacillus,Pediococcus,Leuconostoc,and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresisJ.Appl Environ Microbiol,2001,67(6:2578-2585.8Favier C F,Vaughan E E,De Vos,et al.Molecular monitoring ofsuccession of

21、bacterial communities in human neonatesJ.Appl En-viron Microbiol,2002,68(1:219-226.9Tannock G W,Munro K,Harmsen H J,et al.Analysis of the fecalmicroflora ofhuman subjects consuminga probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20J.Appl Environ Microbiol,2000,66(6:2578-2588.10Heuer H,Krsek

22、M,Baker P,et al.Analysis of actinomycetecommunities by specific amplification of genes encoding16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradientsJ.Appl Environ Microbiol,1997,63(8:3233-3241.11Zoetendal E G,von Wright A,Vilpponen-Salmela T,et al.Mucosa-associated bacteria in the huma

23、n gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered49 (上接第29页表2不同浓度AA 对细胞内脂肪含量的影响组别因子浓度/(mol L -124h 对照-0.357±0.0251×10-40.364±0.0341×10-50.283±0.015*1×10-60.370±0.0233讨论脂肪组织的过度堆积是由于脂肪细胞数目过度增加和体积过度增大引起的,而脂肪细胞由不

24、含脂肪的前体脂肪细胞分化为储存脂肪的成熟脂肪细胞是受许多营养因子、内分泌因子及特异性分化转录因子调控的。目前研究认为,脂肪细胞体积增大即分化失常可能是导致成年个体肥胖的主要原因。因此,在脂肪细胞数目相对稳定的前提下降低细胞内脂肪的生成量以防止细胞体积变大,无疑是一种控制脂肪组织过度堆积的有效手段。本实验用不同浓度的AA 对大鼠前体脂肪细胞进行干扰,结果高浓度(1×10-4mol/L 的AA 和低浓度(1×10-6mol/L AA 可显著提高细胞活力、增加细胞数目。1×10-4mol/L 促增殖作用最明显,但随着时间的延长,其促增殖作用降低,这可能是由于细胞毒性引起

25、的,与Mabile 等6的报道相似,他发现富含多不饱和脂肪酸(PUFA 的乳糜微粒对单核细胞和内皮细胞有很强的毒性。较低浓度的(1×10-5mol/L AA 除第4天外,促增殖作用不明显,开始分化的细胞用1×10-5mol/LAA 处理24h 后细胞内脂滴数目减少、脂肪生成量明显降低,表明较低浓度的AA 在维持细胞数目相对稳定的同时能有效地阻止细胞体积的增大和脂肪的生成,可用来控制动物体内脂肪的沉积。参考文献:1Birch E E,Hoffman D R,Uauy R,et al.Visual acuity and the essen-tiality of docosahe

26、xaenoic acid and arachidonic acid in the diet of term infantsJ.Paediatr Res,1998,44:201-209.2Okuda S,Saito H,Katsuki H.Arachidonic acid:toxic and trophic ef-fects on cultured hippocampal neuronsJ.Neuroscience,1994,63(3:691-699.3袁成凌,姚建铭,余增亮.花生四烯酸及其代谢物的生物学作用J.中国药物化学杂志,2000,(1:75-78.4Bernlohr D A,Coe N

27、 R,Simpson M A,et al.Regulation of gene ex-pression in adipose cells by polyunsaturated fatty acidsJ.Adv Exp Med Biol,1997,422:145-156.5Petersen R K,Jorgensen C,Rustan A C,et al.Arachidonic acid-de-pendent inhibition of adipocyte differentiation requires PKA activity and is associated with sustained

28、 expression of cyclooxygenasesJ.J Lipid Res,2003,44(12:2320-2330.6Mabile L,Salvayre R,Bonnafe M J,et al.Oxidizablity and subse-quent cytotoxicity of chylonlicrons to monocytic U937and endothe-lial cells are dependent on dietary fatty acid composition J.Free Radic Biol Med,1995,19(5:599-607.Applicati

29、on of PCR-DGGE Technique in Animal Intestinal Micro-ecological ResearchHUANG Jun-wen 1,2*,FENG Ding-yuan 2,LIN Ying-cai 1(1.Institute of Animal Science,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Guangzhou 510640,China;2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangdong Guangzhou 510642,ChinaAbstract:The application of PCR-DGGE (i.e.denaturing gradient gel electrophoresisand its principal of analyzing the bacterial community is discussed in this paper,its trait ,operati