多肽类药物冷冻干燥制剂的稳定性研究概况

1、中国药房2009年第20卷第16期Ch ina Pharmac y 2009V ol.20No.161269主管药师。研究方向:临床药学、药事管理。电话:023-*多肽类药物冷冻干燥制剂的稳定性研究概况左筠,张玉方(重庆市江北区第一人民医院药剂科,重庆市400020中图分类号R 965文献标识码A文章编号1001-0408(200916-1269-02随着生物技术的不断发展,蛋白组学计划研究的不断深入,越来越多的多肽及蛋白质类物质被作为药物用于疾病的诊断和治疗。有统计数字表明,这几年蛋白质类药物市场年增长率达到19%,远远超过年增长率仅为9%的总体医药市场1。冷冻干燥是在一定条件下将对热比较敏

2、感或在水溶液中不稳定的药物制成溶液预冻成固体不经过液态而直接升华除去水分的一种干燥方法。由于冻干制剂呈疏松多孔状、能长时间稳定贮存,并易重新复水而恢复活性,因此被广泛应用于制备多肽及蛋白质类药物、脂质体前体2等。然而,多肽类药物冻干制剂在生产和贮存过程中,经常会出现药物失活现象,有时在其制剂表面还会出现凹凸不平或萎缩等现象。引起这些现象的因素很多,本文拟对影响多肽类药物冷冻干燥制剂的稳定性因素进行综述。1玻璃转变温度玻璃转变温度(Glass t ransit ion temperature,Tg是指当溶液浓度达到最大冻结浓缩状态发生玻璃化转变时的温度。它是和过程有关的参数,也是药物冷冻干燥过程

3、中的一个重要参数。在生产过程的第1、第2干燥阶段以及储存过程中,药物温度都必须低于与其浓度变化相应的T g,否则就会影响制剂稳定性,从而影响冻干制剂的外观和内在质量。但干燥温度过低,干燥时间就要延长。为了既保证药物在干燥过程中温度低于T g ,又缩短干燥时间避免能源浪费,最好的方法是提高药物溶液的T g ,即加入T g 高的保护剂,如甘露醇、海藻糖等3,4。2剩余含水量冻干制剂中的剩余含水量,对于多肽及蛋白质类药物稳定性的影响很大,尤其对其活性的复性影响最大5。一般认为其含水量越低,则T g 就越高,该制剂越能长期稳定地储存。通常冻干制剂的剩余含水量要求控制在1%3%,以保持稳定,但并不是剩余

4、含水量越低越好。例如,在相同条件(温度50 ,贮存50d下,对组织型纤维蛋白溶酶原和生长激素2种冻干制剂中剩余含水量的研究,发现其剩余含水量对多肽及蛋白质类药物稳定性有很大的影响6,其结果见表1。表1剩余含水量对2种冻干制剂活性的影响药名剩余含水量/%4.67.6组织型纤维蛋白溶酶原活性基本未变大部分失去活性生长激素失去活性活性基本未变由表1可见,冻干制剂中的剩余含水量对多肽及蛋白质类药物活性有直接的影响。这就表明不同结构的多肽及蛋白质类药物的冻干制剂对于剩余含水量的需求是不一样的。就某一种多肽或蛋白质类而言,剩余含水量过高过低都不利于其稳定。追究其原因,可能是每种多肽类或蛋白质类药物都含有适

5、合于一定剩余水分来稳定的基团,剩余含水量较低或过度的干燥可使多肽分子的这些基团(如极性基团或分子表面的氢键变化而导致变性;过多的水分可使多肽及蛋白质类药物发生氧化变质的几率增多而导致变性。因此,控制适宜于多肽及蛋白质类药物的剩余含水量,这既能满足冻干制剂在保存期稳定的要求,又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。3生产工艺在冷冻干燥过程中会产生多种冻结和干燥应力,使多肽类药物发生不同程度的变性。因此,为了提高药品的稳定性,必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机制进行进一步的研究,优化冻干工艺。以下分别对多肽类药物冷冻干燥过程中的各环节进行阐述。3 1冷冻:无论采取何种冻干形式,在冷冻过程中产生的

6、冻结应力对生物活性多肽都有破坏作用,其机制非常复杂,目前尚无统一的理论,但一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。邬霞等7研究了冷冻保护剂能避免超低温冷冻过程中的溶质效应。3 2干燥:干燥过程产生的干燥应力对多肽类药物也有破坏作用。冷冻干燥全过程分为第1阶段升华干燥(除去90%以上的水分和第2阶段解吸干燥。升华干燥速率与冷冻时产生的冰晶大小有关。第2阶段解吸干燥主要是除去制剂中的残留水分,这部分水分通过范德华力、氢键等弱分子力与多肽类药物结合,被称为结合水分,要去除这部分水分,需要更多的能量。在此阶段温度越高,越有利于药品的彻底干燥,但温度过高会使活性多肽失活。因此,在实际操作中,应该在保证药

7、物活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第2阶段再干燥。在该过程中,为了将干燥应力的破坏作用降至最低需要加入干燥保护剂,包括保持玻璃化的干燥剂8,以保证多肽分子表面的单层水分子不受到破坏。3 3密封保存:干燥好的制剂出箱后要及时密封,否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩9等现象。因此,干燥好的制剂在出箱前必须注意干燥箱温度要高于环境温度;需充入高纯氮气进行保护;并尽快进行密封处理。随着冷冻干燥机的不断改进,目前多采用箱内真空密封或充氮气密封。3 4冻干保护剂及其保护机制:从上述生产工艺过程中笔者得知,冷冻干燥是一个复杂的过程,其过程中产生冻结应力(包括枝状冰晶的形成,离子浓度的增加,pH 值的改

8、变和相分离等和干燥应力(主要是指移去多肽分子表面单层水分子等都会使多肽及蛋白质类药物变性。为了防止药物变性,通常都在其制剂配方中都添加了不同的保护剂,加入的这些保护剂一般应具有吸水性差、玻璃转变温度高、结晶率低和不含还原性基团等特性。常用的保护剂见表2。通常认为,无定型甘露醇具有使多肽及蛋白质类药物稳定的作用,而结晶态的甘露醇则没有稳定功能,如有文献报道10,1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。而与甘露醇或其它糖类相比,海藻糖的玻璃表2常用的多肽及蛋白质冻干制剂保护剂类型保护剂糖类葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖

9、、麦芽糖、菊糖、乳糖多元醇甘油、甘露醇、聚乙二醇、肌醇、硫醇聚合物聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、明胶无水溶剂乙烯乙二醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺表面活性剂吐温-80、普朗尼克、十二烷基磺酸钠氨基酸肌氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸各种酸盐磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐转化温度更高、引湿性和还原性更低,具有更广阔的应用前景11。氨基酸也是常见的蛋白质保护剂之一,在冷冻过程中,低浓度的甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性12。4影响冻干制品贮存期间稳定性的因素贮存温度可能是影响冻干药品稳定性的最重要因素之一。冻干药品贮存过程中,温度必须低于其T g,如环境

10、温度超过冻干制剂的T g,药品的玻璃化状态被破坏,分子运动加快,无定形成分结晶增加,会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等,同时制剂的多孔网状结构被破坏,复水能力减弱13。但有时贮存温度不稳定比单纯高温对药物活性影响更大。残留水分是又一重要因素。总的来说,冻于品越干燥,含水量越低,其T g 就越高,越容易长期稳定地保存,但过度的干燥会使某些药品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。干燥后的药品必须封口保存,以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致,一般对活的微生物、毒株、菌种要求真空封口,对易氧化变质的药品可以采用充氮封口,一般药品可采用普通封口。冻干药品长期贮存时,封口胶塞对药品稳定性也

11、有影响,是由于水分经胶塞进入瓶内使药品中残留水分增加所致。高压蒸气灭菌时水分也可经胶塞进入药品中14。滕菲菲等15也曾报道过温度和湿度对冻干重组水蛭素的稳定性影响非常明显,其贮存条件应为密闭,阴凉处避光保存。5讨论与展望冷冻干燥制剂因其独特的生产工艺,为稳定性差、易被酶降解的多肽类或蛋白质类药物提供了稳定的制备方法。但冷冻干燥是一个非常复杂的物理变化过程,在冻干过程中电解质浓度的改变、溶液pH值的变化以及生产和贮存过程中的温度变化都会对多肽类药物的结构和功能产生影响。保护剂对多肽类药物的稳定起重要作用。不同的多肽类药物需要不同种类和浓度的保护剂,有不同的冻干特性,有些多肽类药物配方中还添加了渗

12、透增强剂及蛋白酶抑制剂,因此广泛开展多肽类药物的个体化研究,优化冻干曲线,是今后多肽类药物冷冻干燥制剂研究的关键。随着对多肽类药物冻干保护机制研究的不断深入,冷冻干燥技术将不仅为多肽类药物提供安全稳定的有效制剂,而且对多肽类药物其它剂型的改进有很大的帮助。如用喷雾冷冻干燥法制备缓释长效的多肽及蛋白质类药物微球制剂,虽然在制备过程中使用的是无水溶剂,避免了油水界面对多肽及蛋白质分子结构的影响,但在喷雾过程中多肽及蛋白质接触的气液界面同样影响其稳定性,也必须加入各种保护剂16。参考文献1李伟 多肽药物!医药市场的亮点J 上海医药,2004,25(3:119 2Li BG,H ua ZZ,Liu Z

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14、halose an except ionalprotein stabilizer?J J Bi ol Chem,2003,278(29:264585S han J,St even LN.Effect of p rocess condition on recover y of p rotein act ivit y after freezin g and f reeze-dryingJ Eu r J Pharm Biopharm,1998,45(3:249 6Hanaf usa N T he behavior of hydrat ion w ater of proteinw it h t he

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17、ins in vacuum-dried glasses Process andstorage st ability in sugar-f ree am ino acid systemsJPharm Dev Technol,1999,4(2:19913Fitz p atrick S,Saklatvala R.U nderstandin g the p h y sicalstabilit y of freeze dried dosa g e forms from the g lasstransit ion tem perat ure of the am orphous component sJ.J Phar m Sci,2003,92(12:249514T em p let on AC,Placek J,Xu H,et al Determinat ion ofthe m oisture conteot of bromobut y l rubber sto pp es as afunction of processing:implicat ions for the stability oflyophilizod productsJ.PDA J Pharm S ci T echnol,2003,57(2:7515滕菲菲,杭长标,蒋文群,等 冻干重组水蛭素的稳定性研究