胃癌组织及癌旁组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析X

1、胃癌组织及癌旁组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析陈彦,贺修胜,容映晖,罗桥,宋颖,龙志峰,苏坚,李艳兰(南华大学肿瘤研究所,湖南衡阳421001【摘要】目的利用蛋白质组学方法建立分辨率高和重复性好的人胃癌组织及其正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,分析其差异表达的蛋白质,为进一步寻找胃癌标志物奠定基础。方法采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人胃癌组织及正常胃黏膜组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,Imaging Master2D图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。结果癌组织和正常胃黏膜组织凝胶的平均蛋白质点数分别为1049±67和1097±73,平均匹配的点数分别为83

2、5±48和953±56,匹配率分别为7916%和8617%。通过比较分析5例胃癌组织及正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,得到平均匹配蛋白点数为769±45,差异表达蛋白点数为81个,其中17个点仅在癌组织中表达,24个点仅在正常胃黏膜中表达,26个点在癌组织中为高表达,14个点在癌组织中为低表达。结论本研究建立了分辨率高且重复性较好的人胃癌组织与正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,发现两者间存在一些差异表达的蛋白质,为进一步筛选胃腺癌特异性的分子标志物打下了坚实的基础。关键词胃癌;双向凝胶电泳;蛋白质组Differential Analysis of Tw o-di

3、mensional G el E lectrophoresis Profiles of G astric C arcinom a and P aired N orm al G astric MucosaCHEN Yan,HE Xiu-sheng,RONG Ying-hui,et al.Cancer Research Institute of Nanhua University,Hengyan421001,China 【Abstract】ObjectiveT o establish tw o-dimensional electrophoresis profiles with high res o

4、lution and reproducibility from human gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues and to analyse the differential expression proteins between the tw o types of the tissues.Methods The total proteins of gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues were seperated by imm ob

5、ilized pH gradient-based tw o-dimen2 sional gel electrophoresis(2-DE.A fter silver staining,the differential expression proteins were analyzed by using Imaging Master2D analysis s oft2 ware.R esultsAverage protein spots were1049±67,1097±73in gastric carcinoma and paired normal gastric muco

6、sa respectively,the matched spots were835±48,953±56in both the tw o types of tissues respectively,and the average matching rate was7916%,8617%respectively.A total of769±45protein spots were matched between the electrophoretic maps of5gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa

7、tissues.The81 differential protein spots were identified between the tw o types of the tissues.17protein spots were expressed only in the gastric carcinoma and24 protein spots were expressed only in the normal gastric mucosa.The expression levels of26protein spots in the gastric carcinoma were highe

8、r than those in the normal gastric mucosa,and the expression levels of14protein spots in the gastric carcinoma were lower than those in the normal gastric mucosa.ConclusionIn this study,the well-res olved,reproducible2-DE patterns of gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues were es

9、tablished and s ome differential proteins between the tw o types of tissues were found.These data will be helpful to further screen specific biomarkers of gastric carcinoma.【K ey w ords】G astric carcinoma;T w o-dimensional electrophoresis,2-DE;Proteome胃癌属常见恶性肿瘤之一,在我国其发病率及死亡率高居各类恶性肿瘤之首,严重威胁着人们的健康和生命。

10、在胃癌发病分子机理的研究方面,虽从基因(DNA和基因转录(mRNA水平进行了大量的研究1。然而基因的功能是通过其表达的蛋白质来实现的,若能直接从蛋白质水平入手来研究胃癌,将能更加全面、真实地揭示胃癌癌变过程中的分子事件。随着蛋白质组学的问世及其相关技术的不断发展与完善,肿瘤蛋白质组学研究已成为当今肿瘤研究的热点课题2。本研究应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离4G ehring W J,A ffolter M,Burglin T,et al.H omeodomain proteinsJ.Annu Rev Biochem,1994,63:487-5265S cott MP.Vertebrate

11、h om eob ox gene n om enclatureJ1C ell,1992,71:551-553 6Bodey B,b odey B J,S iegel SE,et al.Immun ocytochem ical detection of theh omeob ox B3,B4,AND C6gene products in childh ood medulloblastmas/prom i2tive neuroectodermal tum orsJ.Anticancer Res,2000,20:1769-17807Bostrom K,T intnt Y,K ao SC,et al,

12、H OX B7overexpression prom otes dif2ferentiation of C3H10T1/2cells to sm ooth muscle cellsJ.J cell Biochem, 2000,78:210-2218Fuller JF,Achdara J,Y aron Y,et al.Characterization of H OX gene expres2 sion during myelopoiesis role of H OX A5in lineage commitment and matura2 tionJ.Blood,1999,93:3391-3400

13、收稿日期:2002-12-04244Journal of Chinese Physician,April,2004,V ol6,N o4通讯作者T el:0734-*,Email:hxs59基金项目:湖南省教育厅课题基金资助项目(018016,97B095;湖南省卫生厅课题基金资助项目(Y02-069人胃癌组织及正常胃黏膜组织的总蛋白质,建立双向凝胶电泳图谱,采用Imaging Master2D图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质,以期为寻找与人胃腺癌发病相关的蛋白质奠定基础。1材料和方法1材料111标本5例胃癌样本,胃癌组织及配对的正常胃黏膜组织(距癌组织>10cm远端的胃黏

14、膜取自本校附一医院手术切除胃癌标本(2002-03-04,所有标本均经病理确诊,5例胃癌均为高分化腺癌。112试剂硫脲、二硫苏糖醇(DTT、碘乙酰胺(Sigma公司产品;固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3 -10L,24cm、覆盖液、蛋白银染试剂盒、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、CH APS、S DS (Amersham Biosciences公司产品。113仪器IPG phor等电聚焦仪、Imaging Master2D Elite4101凝胶图像分析软件、Ettan Dalt垂直电泳仪为Amersham Biosciences公司产品。12方法121组织标本

15、的处理无菌条件下切取手术后新鲜的胃癌组织及距肿瘤>10cm的正常胃黏膜组织,用生理盐水反复清洗组织,以去除血液,尽可能剪去其他组织,处理后的样品立即用于蛋白质的抽提或置于-80保存备用。122组织总蛋白质的制备按Araki等的方法进行3。123固相pH梯度双向凝胶电泳按G org等的方法进行4。124凝胶图像分析凝胶通过Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件进行扫描获取图像,利用Imag2 Master2D Elite4101分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1D校正、建立平均凝胶分析等。斑点位置的重复性按C orbett的方法5进行计算。所有数据的统

16、计分析在SPSS1010软件和Excel上进行。2结果同一标本的总蛋白质,选择上样量为0175mg,进行3次重复检测。发现3次双向电泳图谱非常相似,采用Imagescanner扫描仪扫描获取图像,然后通过Imaging Master2D Elite4101分析软件进行点分析,获得胃腺癌组织及对应正常胃黏膜组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1049±67和1097±73。这些蛋白质等电点和分子量分布范围较广,但大多数集中于pH 值4-8,分子量14-116kD区域。经过背景消减后,将其中的一块胶定为参考胶进行3块胶间的蛋白质点的匹配,胃腺癌组织及配对的正常胃黏膜组织平均匹配的

17、点数分别为835±48和953±56,匹配率达7916%和8617%。再任意选取同一癌组织的3块胶中相互匹配且分辨清晰的50个蛋白质点,选择位置偏中间的一个点为原点,以参考胶为参考位置,测量出其它两块胶对应点在第一向IEF及第二向S DS-PAGE方向上位置的偏差。发现3块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(01873±01125mm,在S DS-PAGE方向上的偏差为(11025±01213mm,因此获得了重复性较好的人胃腺癌组织及对应正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱(见图1,2。对两组凝胶电泳图谱进行匹配分析,得

18、到平均匹配点数为769±45。对5例胃腺癌组织及其配对的正常胃黏膜组织的蛋白质进行双向凝胶电泳,发现5例癌组织的银染图谱较相似,利用Imaging Master2D Elite4101分析软件对其进行分析匹配,从而建立了5块胶的平均凝胶图,点检测共有蛋白质点1342个。用相同的方法对5例配对的正常胃黏膜组织双向凝胶电泳图谱进行软件分析,亦建立起其平均凝胶图,点检测共有蛋白质点1253个,将建立的平均凝胶进行匹配用于两组图谱的差异表达分析。3讨论随着人类大规模草图测序工作的完成,标志着以蛋白质学研究为主要研究内容之一的后基因组时代的来临及肿瘤蛋白质组学的兴起。从蛋白质水平探索肿瘤发生发

19、展的分子机制,是当今肿瘤研究的新热点。研究表明,大量的蛋白质分子参与了肿瘤细胞周期、凋亡及转移的调控6。而蛋白质组学将为肿瘤发病机理研究、肿瘤标志物的筛选提供新的平台7。目前蛋白质组学研究主要包括两个方面:一个方面是建立机体组织或细胞的蛋白质组2D-PAGE参考图谱和数据库;另一个方面是通过比较生理和病理条件下(如疾病状态或疾病不同发展阶段蛋白质成分在表达水平、修饰加工以及亚细胞定位等方面的改变情况,从而发现和鉴定出疾病相关的蛋白质(群,进一步筛选出特异的疾病生物标志物。为了更真实揭示胃癌蛋白质表达谱、识别与鉴定出胃癌相关的蛋白质,本研究采用人胃腺癌组织及配对的正常胃黏膜组织的蛋白质表达谱进行

20、分析,以期更能准确反映胃癌蛋白质的表达状况。考虑到组织标本的获取过程有可能受到多方面因素如血液、结缔组织等的影响,故在取材时应尽可能的去除间质成分,对取得的标本进行清洗以去除血液,并尽可能地获得较344中国医师杂志2004年4月第6卷第4期纯净的肿瘤细胞等,这样可以得到比未经上述处理更真实反映组织蛋白质表达状况的电泳图谱。重复性问题也是双向凝胶电泳中的关键问题,在实验样品制备、二向电泳凝胶制备以及银染等过程中应尽可能保持一致,上述条件的一致是保证结果重复性好的关键所在。本文利用Imaging Master 2D 分析软件建立了人胃腺癌组织的平均凝胶(一组凝胶经统计学处理合并在一起生成的模拟凝胶

21、,所谓平均凝胶是指同种样品的一组凝胶中最具代表性的一张凝胶,它包含信息更多,采用它来进行差异蛋白表达分析更具代表性,并为进一步的质谱分析研究提供有利的条件8。本研究结果显示, 在胃癌组织与正常胃黏膜组织之间存在差异表达蛋白质,其差异表达蛋白点数为81个,其中17个点仅在癌组织中表达,24个点仅在正常对照中表达,26个点在癌组织为高表达 (表达量高于正常胃黏膜组织的5倍以上,14个点在癌组织为低表达(表达量低于正常胃黏膜组织的5倍以上。通过对这些差异蛋白质点的质谱分析鉴定,将有助于筛选出胃癌癌变相关的或特异的蛋白质分子。本项研究的蛋白质质谱鉴定工作正在进行中,以期能寻找到胃癌癌变相关的或特异的标

22、志物。(志谢本文实验在中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组重点实验室完成,特此致谢图1胃癌组织的双向凝胶电泳图谱带有圆圈的点表示仅在癌组织中检测到的蛋白质点,带有三角形的点表示在胃癌中蛋白表达量高于正常胃黏膜5倍以上的蛋白质点,带有矩形的点表示在胃癌中蛋白表达量低于正常胃黏膜5倍以上的蛋白质点图2正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱带有圆圈的点表示仅在正常胃黏膜组织中检测到的蛋白质点(下转第492页断、处理髋臼骨折中价值极大,能较好的显示关节腔内碎骨片,骨折移位和股骨头损伤等情况,有助于选择切口、术式、内固定方式等。CT三维重建更有助于立体地了解骨折情况4。32治疗方式和手术时机的选择因髋臼骨折属关

23、节内骨折,其疗效的好坏取决于完整的臼顶和股骨头-臼的良好关系。故治疗上要求尽可能解剖复位并予可靠的固定,以利髋关节早期功能锻炼,减少并发症的发生。作者在实践中体会到凡累及臼负重弓的骨折,单纯骨牵引疗效都不佳,因髋臼骨折移位,月状关节面大多有台阶,不光滑,而手术可将骨折解剖复位,清除游离体,固定确实,减少卧床时间,早期功能锻炼,减少骨性关节炎和关节僵硬的发生。本组结果表明,髋臼骨折手术指征为凡经髋臼负重骨折移位>3mm,髋臼内有碎骨片,后壁、后柱骨折、CT片呈示缺损> 40%,尤其是髋关节后脱位者,髋臼后壁骨折伴坐骨神经压迫症状,观察一周不见好转者,中、青年患者骨折复位及功能恢复要求

24、较高、非手术治疗失败者。髋臼骨折特别是复合型的髋臼骨折,多糸高能量创伤所致,常伴有其它部位或脏器的损伤,应优先处理危及生命的合并伤,伤肢行骨牵引制动,若伴有股骨头中央型脱位而无复位条件可行股骨髁+股骨粗隆侧方牵引。一般髋臼骨折的最佳手术时间是患者全身情况稳定后尽可能在210d内进行5,超过二周,由于血肿机化、软组织的挛缩和早期骨痂形成,均妨碍骨折复位的操作,强行复位势必造成广泛的显露,使异位骨化等并发症占率增大。33手术入路髋臼骨折复位质量与手术显露直接有关,经术前Jadet X线片和CT片,可以对骨折类型有良好认识,但没有一种手术入路适用于所有类型的髋臼骨折内固定,一般后侧K ocher-L

25、angenbach切口用于髋臼的后壁、后柱骨折、横型或T型骨折,创伤小显露好。前侧髂腹股沟入路适用于前柱和前壁骨折,该切口能够显露骨盆及髋臼的前内侧面,但此切口解剖关系较复杂,术中应显露三个“窗口”,第一窗为外侧窗口,即内侧骼窝。第二个窗口是位于髂腰肌和股神经与髂血管之间的髂耻线和方形区。第三个窗口称为内侧窗口即耻骨后间隙,如合并骶髂关节骨折脱位或耻骨骨折和耻骨联合分离,可通过髂腹股沟切口一次完成。对于双柱骨折伴后壁骨折等复杂型髋臼骨折宜采用二者联合入路,体位采用“懒散侧卧位”依次或同时进行复位、内固定。本组62例中,选择髂腹股沟入路13例,K ocher-Langenbach入路31例,二者

26、联合入路18例,由于术前诊断明确,没有1例因入路选择不当,暴露不充分而影响复位固定。另外术中对于髋臼壁的骨折块尽量不予剥离,尽量不切开关节囊,或因骨折复位需要,或需清除关节内碎骨片,亦仅作有限暴露关节囊,以最大限度保证骨折块和股骨头的血供,本文62例病例中无1例发生骨折不愈合或并发股骨头无菌坏死。参考文献1吴阶平,裘法祖,黄家驷1外科学(第5版M1北京:人民卫生出版社,1991,2252-22582卢世壁主泽.坎贝尔骨科手术学(第9版M.济南:山东科学技术出版社,2001,2181-21983M atta JM.Operative treatment of acetabular fractur

27、e through the ilioinguinal approachJ.Clin Orthop,1994,(305:10-194王林森,宋其韬.螺旋CT扫描三维多平面重建在髋臼骨折中的应用J.中华骨科杂志,2002,10:608-6125W eber M,Berry D J,Harmsen WS.T otal hip arthropasty after operative treat2 ment of an acetabular fractureJ.J Bone Joint Surg(Am,1998,80(9: 1295-1305收稿日期:2003-07-29(上接第444页参考文献1Sek

28、ido Y,F ong K M,M inna JD.Progress in understanding the m olecular pathogenesis of human gastric adenocarcinomaJ.Biochim Biophys Acta, 1998,1378(1:21-592H irano T,Fujioka K,Franzen B,et al.Relationship between T AO1and T AO2polypeptides ass ociated with gastric adenocarcinoma and histocytologi2 cal featuresJ.Br J cancer,1997,75(5:978-9853Araki N,M orimasa T,Sakai T,et al.C om parative analysis of brain proteins from P53-decificient mice by tw o-dimensional electrophoresisJ.E lec2 trop