乌拉甘草有效成分对人体４ 种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响

1、乌拉甘草有效成分对人体 种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响    Tags：乌拉 增殖 甘草 作者：马淼 周旭莉 户元林 肖辉 李学禹【摘要】 目的测定乌拉甘草提取物对人体 种肿瘤细胞的抑制效果。方法应用 法测定甘草水提物（甘草酸）与醇提物（总黄酮）对宫颈癌细胞株（）、乳腺癌细胞株（ ）、胃癌细胞株（ ）以及肝癌细胞株（ ）增殖的抑制作用；运用 荧光染色剂测试其诱导细胞凋亡的生物学效应。结果甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性，与浓度呈正相关关系。高浓度甘草酸（ ）对 ， 的增殖均有较强的抑制作用，其抑制率分别为，对 细胞增殖的抑制作用较差，抑制率仅为。在一定浓度范

2、围内（ ），其对 种肿瘤细胞增殖的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系， 剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳，其对 ， ， 等 种肿瘤细胞增殖的抑制率分别为，以及。甘草酸、甘草黄酮均能有效诱导这 种肿瘤细胞发生凋亡。结论甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显著抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。 【关键词】 乌拉甘草 甘草酸 酮 抗肿瘤 细胞凋亡Abstract:Objective Glycyrrhiza uralensis （ ：， ： ， ： ： ） Methods ， Results ， （ ） ， （ ）， ry ， （ ） ry ， ， ， ， ， Conclusion Key words:G

3、lycyrrhiza uralensis； ； ； ； 乌拉甘草Glycyrrhiza uralensis 为豆科甘草属多年生草本植物 ，是中国药典中收录的药用甘草之一，其性平味甘，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效 。其有效成分主要为甘草酸类和甘草黄酮类物质。最近研究表明甘草酸还具有抑制肺癌细胞增殖的作用 。本研究以人宫颈癌细胞株（ ）、人乳腺癌细胞株（ ）、人胃癌细胞株（ ）以及人肝癌细胞株（ ） 种肿瘤细胞作为研究对象，通过体外实验研究甘草有效成分的抗肿瘤活性及其诱导细胞凋亡的效果，为甘草提取物抗肿瘤实验的研究以及甘草新药的开发提供理论依据。1 器材与方法 提取物

4、的制备 甘草酸的制备乌拉甘草的根茎采自石河子大学甘草资源圃，烘干至恒重后粉碎成粉末，过 目筛。准确称取 样品干粉，加 蒸馏水，于室温条件下放置 ， 离心 ，取 上清液加 甲醇混匀， 离心 ，取上清液，用孔径为 的微孔滤膜过滤， 法测定甘草酸含量。 甘草黄酮的制备准确称取 样品粉末，用 无水乙醇加 滴浓盐酸为提取剂在索氏提取器中于的水浴加热条件下提取 ，浓缩至 ，冷却至室温后补足溶剂至刻度，用孔径 的微孔滤膜过滤，用 酚试剂法测定总黄酮含量。2 细胞株人宫颈癌细胞株（）、人乳腺癌细胞株（ ），人胃癌细胞株（ ），人肝癌细胞株（ ），均由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。 设备及试剂1 仪器

5、 分析仪（）、紫外可见分光光度仪（上海棱光）、 培养箱（美国）、 自动酶标仪（）、荧光显微镜（ ）、超净工作台（上海净化设备厂）、血球记数板（上海医用光学仪器厂）、倒置显微镜（重庆）、超速离心机。2 试剂（） 、小牛血清（杭州四季青公司）、胰蛋白酶（） 、二甲基亚砜（分析纯）、甲醇（色谱纯）、四噻唑蓝（）、顺铂（，江苏豪森药业股份有限公司）、 染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。 方法及观察指标1 细胞培养细胞用含灭活小牛血清的 培养基，置于， 孵箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期，常规苔酚蓝计数活细胞大于。2 体外抗肿瘤实验体外抗肿瘤实验分 个浓度（ ） 、阴性对照（含同一细胞密度的培养液

6、）、空白对照。对数生长期细胞（细胞密度为 × 个） 孔接种于 孔板，饱和湿度， 条件下培养 ，待细胞均已贴壁，加入 不同浓度的受试物，各设 个复孔。在 取出 孔板，倒置显微镜下观察后，每孔加 溶液（ ） ，继续孵育 ，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入 ，振荡 ，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收OD 值（A ），记录结果。抑制率（） （ 给药组A 细胞对照组A ）× 细胞凋亡率实验细胞凋亡实验在同一浓度下进行（甘草酸 ，黄酮 ），实验设阴性对照（含同一细胞密度的培养液）、阳性对照（ ）、空白对照。取普通、洁净盖玻片于 乙醇中浸泡 ， 溶液洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤

7、一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为 满。加入样品，继续培养，吸尽培养液，加入 固定液，固定 。去固定液，用 洗两遍， 次，吸尽液体。加入 染色液，染色 。用 洗两遍， 次。滴滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。荧光显微镜下（ ， ）随机选取 个视野拍照后计数。凋亡率（%）凋亡细胞（视野总细胞数） ×。 统计学处理实验所得所有数据均经 软件处理并对处理组间进行单因素方差分析，P 时表示存在显著性差异。2 结果 甘草酸体外抗肿瘤实验结果光镜下观察到，未经任何处理的肿瘤细胞接种 后，细胞约占孔底面积的 。高剂量甘草酸处理肿瘤细胞 时，细胞数量少，间距大，多

8、数细胞体积固缩变小、失去原有肿瘤细胞形态而略呈圆形、椭圆形，说明对肿瘤细胞的生长与增殖具有显著的抑制作用。结果见表。表1 甘草酸对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应（略）从表 可见甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性，与浓度呈正相关关系。高浓度甘草酸（ ）对 ， 的增殖均有较强的抑制作用， 其抑制率分别为，对 细胞增殖的抑制作用较差，抑制率仅为。 甘草黄酮体外抗肿瘤实验结果(见表)。从表 中可得知，甘草黄酮处理肿瘤细胞 后，在一定浓度范围内（ ），其对 种肿瘤细胞的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系，即样本浓度越低，对肿瘤细胞的抑制率越高， 剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳，其对 ， ， 等 种肿瘤

9、细胞增殖的抑制率分别为，以及；在极低浓度时（ 的剂量），甘草黄酮对这 种肿瘤细胞生长均无明显抑制作用。表2 甘草黄酮对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应（略）2.3 细胞凋亡实验从图 中可以看到， 种肿瘤细胞经荧光染色后，正常细胞的细胞核呈弥散均匀状，凋亡细胞的细胞核由于凋亡致使细胞核固缩成团，在荧光下呈致密浓染或碎块状，颜色较正常细胞更深更亮。甘草活性成分诱导 细胞凋亡的实验结果见表。表3 不同处理对4种肿瘤细胞凋亡的影响（略）本研究中我们以临床常用肿瘤治疗药物顺铂做阳性对照，从结果中我们可以看出与阴性对照组相比甘草黄酮与甘草酸均具有极显著的诱导 种肿瘤细胞凋亡的生物学效应（P），甘草黄酮能很好的诱

10、导人乳腺癌细胞（ ）、人宫颈癌细胞（）以及人肝癌细胞（ ）的凋亡，其效果均优于等剂量的顺铂；而对胃癌细胞凋亡的诱导效果不及顺铂。高浓度（ ）的甘草酸只对人宫颈癌细胞（）的诱导凋亡效应与 的顺铂相当，对其余细胞的诱导凋亡效果均不及顺铂。图1 阴性对照组（×400）（略）图2 阳性对照组（×400）（略）图3 样品处理组（×400）（略）3 讨论细胞凋亡是一种与细胞坏死具有不同形态及生化特征，且受基因调控的主动性细胞死亡。与诱导细胞坏死相比，通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反应 。因此，通过诱导细胞凋亡来杀伤和清除肿瘤细胞，已经成为一种筛选抗癌药的快速

11、有效的方法。为了探讨甘草活性成分甘草酸、甘草黄酮在抗肿瘤作用中的潜在治疗价值，实验中笔者以人宫颈癌细胞（）、人乳腺癌细胞（ ）、人胃癌细胞（ ）、人肝癌细胞（ ）为研究对象，以顺铂作为阳性对照（铂类药物具有较强的抗肿瘤活性），观察甘草酸、甘草黄酮对这种肿瘤细胞的增殖抑制及其诱导凋亡作用。结果显示甘草黄酮类化合物对人宫颈癌细胞（）、乳腺癌细胞（ ）以及肝癌细胞（ ） 的增殖均具有显著的抑制及诱导细胞凋亡的效果；甘草酸只在高浓度条件下才对人胃癌细胞（ ）显示出较强的抑制增殖作用，其对胃癌细胞（ ）的诱导凋亡效应不佳（不及顺铂），这与以往的研究结果是一致的7。综上所述，甘草酸、甘草黄酮抑制这 种肿瘤细胞增殖与诱导其细胞凋亡的结果是相一致的；因此，甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显著抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。鉴于甘草黄酮类化合物的抑瘤效果优于甘草酸，所以在进行甘草抗癌药物筛选时，应优先考虑甘草黄酮类物质。【参考文献】1 中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志， 卷 分册北京：科学出版社，：2 国家药典委员会中国药典，部北京：化学工业出版社，：3 ， ， ， ， （中国肿瘤），（）：4 谢 彦，