12基因工程的基本操作程序

1、1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建 3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤详细过程一、目的基因的获取一、目的基因的获取（指编码蛋白质的基因指编码蛋白质的基因）目的基因目的基因供体供体DNADNADNADNA片段片段信使信使RNARNA目的基因目的基因逆转录逆转录合成合成肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因基因DNADNA序列序列目的基因目的基因合成合成推测推测直接提取法直接提取法（已有的物种分离）（已有的

2、物种分离）人工合成法人工合成法逆转录法逆转录法化学合成法化学合成法cDNA合成1 1、从基因文库中提取目的基因从基因文库中提取目的基因基因文库概念基因文库概念n又称又称DNADNA文库，将含有某种生物不同基因的许文库，将含有某种生物不同基因的许多多DNADNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称基受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称基因文库。因文库。n基因文库由基因文库由外源外源DNADNA片段、载体和宿主组成。片段、载体和宿主组成。u基因文库基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相应基因，而是应基因，而是保存受体菌保存受

3、体菌，受，受体菌中含基因体菌中含基因P9P9寻根问底寻根问底: :有了基因文库，就可随时从有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因引中提取所需要的目的基因引入受体细胞使之表达。入受体细胞使之表达。PCR基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因组文库和部分基因文库基因组文库和部分基因文库(cDNA文库文库)比较比较2 2、利用、利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一项在生物：是一项在生物体外复制特定体外复制特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷酸；引物；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNADNA

4、聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）利用利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。即即2n （n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）1、概念：、概念：2、原料：、原料：3、PCR的基本原理的基本原理前提前提: :已知目的基因的脱氧已知目的基因的脱氧核苷酸序列核苷酸序列方法：方法：DNADNA受热变性受热变性解旋为单链、冷却后解旋为单链、冷却后DNADNA引物与单链相应引物与单链相应互补序列结合、互补序列结合、DNADNA聚合酶作用下延伸合聚合酶作用下延伸合成互补链成互补链。指数增

5、长归纳1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物结合DNA变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸DNA加倍q从基因文库中获取从基因文库中获取q利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增q利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法2构建载体二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建组成组成q目的基因目的基因q启动子启动子q终止子终止子q标记基因标记基因使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中中

6、稳定存在稳定存在；可以；可以遗传遗传给下一代；使目的基因给下一代；使目的基因能够能够表达表达和发挥作用。和发挥作用。目的：目的：非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核不能编码蛋白质调控遗传信息能编码蛋白质编码蛋白质的序列不编码蛋白质的序列真核细胞基因结构的主要特点是真核细胞基因结构的主要特点是:编码区是间隔的、不连续的。编码区是间隔的、不连续的。位于基因的首端，是位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出结合的部位，驱动基因转录出mRNA。

7、位于基因的尾端，相当于一盏红色信号位于基因的尾端，相当于一盏红色信号灯，使转录停止，。灯，使转录停止，。启动子：启动子：终止子：终止子：用与提取目的基因用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互与切口上的黏性末端互补配对后，在补配对后，在DNADNA连接连接酶的作用下连接形成重酶的作用下连接形成重组组DNADNA分子。分子。目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合步骤获取目的基因获取目的基因载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因

8、的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方

9、式携带进去。注意注意1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力农杆菌中的农杆菌中的Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转移到可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。上。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞原理：原理：过程过程补充归纳导入方法（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）染植物细胞）1 1

10、、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞1 1、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法导入动物导入动物2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细

11、胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的首先取出转基因生物的基因组基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的使探针和转基因生物的基因组基因组DNA杂交杂交,若显示出杂交带若显示出

12、杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究（二）

13、、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若若出现杂交带出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA过程过程四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定n检测检测: :q是否插入目的基因（是否插入目的基因（DNADNA分子杂交分

14、子杂交技术）技术）q是否转录（是否转录（分子杂交分子杂交技术）技术）q是否翻译（是否翻译（抗原一抗体抗原一抗体杂交杂交）n鉴定鉴定: :q功能活性鉴定功能活性鉴定q抗性鉴定抗性鉴定归纳步骤归纳归纳: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取目的基因的获取u 从基因文库中获取从基因文库中获取u 利用利用PCR技术扩增技术扩增u 利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注

15、射法、Ca离子转化法离子转化法4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译 鉴定鉴定: :q功能活性鉴定功能活性鉴定q抗性鉴定抗性鉴定练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处

16、，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）aa练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，技术，（4）为了确定

17、耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交检测，又要用 方方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌水稻一定浓度盐水浇灌水稻思考与探究思考与探究n3、有些蛋白质肽链上有共价结合的糖有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体链，这些糖链是在内质网和高尔基体复合体上加工完成的，内质网和高尔复合体上加工完成的，内质网和高尔基体复合体存在于真核细胞中，大肠基体复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器。因此，在杆菌不存在这两种细胞器。因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的的4、从小鼠中克隆出、从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序珠蛋白基因的编码序列列在编码序列前接上在大肠杆菌中可以适