细胞培养技术CellCultureTechnique

1、温州医学院检验医学院温州医学院检验医学院陶志华陶志华 1.上皮组织的形态结构 群体依赖性（population dependence) 接触抑制（contact inhibition) 2.上皮细胞的极性 贴壁依赖性细胞-贴壁生长 生长基质 3 . 上皮细胞间的连接1. 形态学结构：形态学结构： 均质性、透明性很强，结构不明显均质性、透明性很强，结构不明显(1) 体外培养的特殊条件：体外培养的特殊条件： a. 防范微生物污染防范微生物污染 b. 生长基质的基质生长基质的基质 c. 特殊的培养基特殊的培养基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养基无血清培养基 d. 去

2、成纤维细胞去成纤维细胞 体内：机体自身神经和内分泌因素体内：机体自身神经和内分泌因素 体外：促细胞增殖因子和促细胞分化因子体外：促细胞增殖因子和促细胞分化因子 细胞增殖态细胞增殖态细胞分化态细胞分化态1. 一般形态学观察一般形态学观察 光镜：光镜： 形态、轮廓、生长情况等。形态、轮廓、生长情况等。 细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜：电镜： 桥粒、形态结构特征、细胞间关系桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液培养液pH变化：变化： 颜色变化？颜色变化？培养物的污染情况：培养物的污染情况： 透明度变化？透明度变化？ 2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测组织

3、化学与免疫组织化学观察与检测酶类：酶类： 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原角蛋白、上皮细胞膜抗原 VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白组织来源：组织来源： 婴儿脐带婴儿脐带培养用液：培养用液： M199+20%FCS D-Hanks 0.1%胶原酶溶液胶原酶溶液培养用具：培养用具：1.主要材料：主要材料：2.培养方法：培养方法： 分离细胞培养法 (1) 关于接种材料的制备关于接种材料的制备 取材与消化取材与消化 消化酶、浓度、时间消化酶、浓度、时间 (2) 排除成纤维细胞排除成纤维细胞 传代去

4、除法传代去除法 加肝素培养法加肝素培养法(90u/ml) 刮除法刮除法 (3) 关于培养液关于培养液 (4) 关于传代培养关于传代培养5.讨论： (1) 光镜检查光镜检查 (2) 透射电镜检查：透射电镜检查： W-P小体小体 (3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测因子相关抗原的免疫组化检测6. 内皮细胞的鉴定：内皮细胞的鉴定：1. 主要材料：主要材料： a. 细胞来源：细胞来源： b. 无血清培养液：无血清培养液： 基础培养液：基础培养液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物：添加物： 胰岛素胰岛素 5 g/ml 转铁蛋白转铁蛋白5 g/ml 硒硒 5 g/ml 氢化可的松氢化可的松

5、36ng/ml T3 4 ng/ml EGF 10 g/ml c. 消化液：消化液： 0.2%胰蛋白酶胰蛋白酶d. 细胞筛网：细胞筛网： 80和和100目目2.原代培养：原代培养：切取切取1cm3外层肾皮质、剪碎成外层肾皮质、剪碎成1mm3 80目研磨冲洗、于目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段目上收集肾小管节段0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养每隔每隔34天，更换培养液天，更换培养液3.传代培养：传代培养：4. 培养结果：培养结果： 3d 长出细胞长出细胞 57d 进入对数生长期进入对数生长期

6、 79d 融合成单细胞层融合成单细胞层5.鉴定：鉴定： 抗角蛋白抗体染色（抗角蛋白抗体染色（+）6.注意事项：注意事项：a. 分离方法：分离方法：b. 鉴定方法：鉴定方法：动物：动物： 小鼠、大鼠、兔、人小鼠、大鼠、兔、人培养基：培养基： Eagle MEM RPMI1640 HamF12常用的巨噬细胞：常用的巨噬细胞： 肺泡和腹腔巨噬细胞肺泡和腹腔巨噬细胞（一）肺泡巨噬细胞（一）肺泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法支气管肺泡灌洗法 支气管镜肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞（二）腹腔巨噬细胞 1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取：小鼠腹腔巨噬细胞的获取： (1)主要材料：主要材料： 实验动物实

7、验动物: 6周龄小鼠周龄小鼠 培养液：培养液： 10%FCS RPMI1640 1、原理：、原理： 巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 贴附培养时间贴附培养时间 贴附培养温度贴附培养温度2. 方法：方法： 常规差速黏附处理：常规差速黏附处理： 低温差速黏附处理：低温差速黏附处理：（一）主要材料：（一）主要材料： 培养液：培养液： RPMI1640 等等+1040%FCS+抗生素抗生素 （二）实验步骤：（二）实验步骤： a. 冷分离冷分离 b. 调整细胞浓度：调整细胞浓度：24106/ml c. 接种培养接种培养（三）培养结果：（三）培养结果：大大 小：小： 2050

8、m形形 态：态： 菱形、星形、圆形菱形、星形、圆形功功 能：能： 吞噬功能吞噬功能增殖情况：增殖情况： 不增殖、存活不增殖、存活13周周（四）巨噬细胞的鉴定（四）巨噬细胞的鉴定1. 吞噬实验：吞噬实验： 加入加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡吞噬泡2. 抗胰蛋白酶消化能力试验：抗胰蛋白酶消化能力试验： 0.25%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min、再用吸管反复吹打、再用吸管反复吹打 细胞变园但不脱落细胞变园但不脱落3. 细胞化学试验：细胞化学试验： ACP酶染色：棕黑色酶染色：棕黑色 NSE酶染色：紫蓝色酶染色：紫蓝色表面标志：表面标志： 1.表面受体： TCR SRBC

9、 R Fc R MR Measles viruse RT淋巴细胞：淋巴细胞： MHC CD2. 表面抗原1. 表面受体表面受体 BCR FcR CR 丝裂原受体丝裂原受体 EBV R2. 表面抗原表面抗原 MHC抗原抗原 CD抗原（抗原（CD19、20、 21、23、45）密度梯度离心法密度梯度离心法1. 玻璃黏附法玻璃黏附法2. 羰基铁粉法羰基铁粉法1. T细胞花环沉降法细胞花环沉降法2. 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法（五）（五）FACS仪分离仪分离（六）免疫磁珠法（六）免疫磁珠法1. 用用IL-2建立建立T淋巴细胞克隆淋巴细胞克隆2. 用用EB病毒转化病毒转化B淋巴细胞淋巴细胞3. 用用B

10、细胞生长因子建立细胞生长因子建立B淋巴细胞株淋巴细胞株肿瘤细胞在体外的生长生物学特性肿瘤细胞在体外的生长生物学特性1、肿瘤细胞永生性的保持、肿瘤细胞永生性的保持2、形态学变化、形态学变化3、细胞具有更高的增殖能力、细胞具有更高的增殖能力4、细胞表面形状的改变、细胞表面形状的改变5、接触抑制减弱或消失、接触抑制减弱或消失6、悬浮生长特性、悬浮生长特性7、成瘤性的特性、成瘤性的特性RPMI1640+1020%FCS+0.03%谷氨酰胺：谷氨酰胺： 上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞DMEM、199、MEM： 肉瘤细胞的培养肉瘤细胞的培养F12、L-15: 上皮性癌细胞的培养（

11、如肝癌细胞）上皮性癌细胞的培养（如肝癌细胞）加加: 2 g/L NaHCO3 20 mmol/L HEPES肿瘤细胞体外培养常用的培养基肿瘤细胞体外培养常用的培养基（一）培养液的种类和选择（一）培养液的种类和选择（二）培养液特殊添加剂（二）培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂添加剂 终浓度终浓度 BSA 10-5 mol/ml TRF 510 ug/ml Insulin 5 ug/ml 氢化可的松氢化可的松 10-6mol/ml EGF 5 ng/ml FGF 5 ng/ml NGF 5 ng/ml肿瘤组织细胞的原代培养肿瘤组织细胞的原

12、代培养（一）取材（一）取材 转移癌标本？转移癌标本？ 原发癌标本？原发癌标本？l组织形态学：组织形态学： 识别目的细胞识别目的细胞l成功捕获细胞成功捕获细胞l目的分子的完整性目的分子的完整性（二）植块培养法（二）植块培养法 建立细胞培养档案：建立细胞培养档案： 病理切片、免疫组化、病理切片、免疫组化、HE染色。染色。 步步 骤：骤：（三）分散细胞培养法（三）分散细胞培养法 1、组织细胞分离：、组织细胞分离： 机械分散法机械分散法 胶原酶分散法胶原酶分散法 2、 接种密度：接种密度： 1106/ml 45ml/25cm2培养皿或培养瓶培养皿或培养瓶（四）含肿瘤细胞的体液培养法四）含肿瘤细胞的体液

13、培养法 (五）原代培养的一般结果：五）原代培养的一般结果： 成纤维细胞的生长成纤维细胞的生长淋巴细胞淋巴细胞巨噬细胞巨噬细胞上皮性癌细胞上皮性癌细胞植块周边的细胞植块周边的细胞细胞间隙细胞间隙1、刮除法、刮除法2、差速黏附法、差速黏附法3、酶消化法、酶消化法4、磁珠法细胞分选、磁珠法细胞分选（六）去除成纤维细胞的方法（六）去除成纤维细胞的方法1、不同培养方法的生长情况、不同培养方法的生长情况2、传代：、传代：3、原代培养过程中避免污染和耐心操作、原代培养过程中避免污染和耐心操作（七）注意事项：（七）注意事项：（一）（一） 首次传代首次传代（二）继续传代（二）继续传代1、集落克隆法：、集落克隆法

14、： a. 不锈钢圈法不锈钢圈法 b. 滤纸法滤纸法 c. 吸管吹打法吸管吹打法2. 单个细胞克隆培养法单个细胞克隆培养法 a. 有限稀释法有限稀释法 b. 毛细管分离法毛细管分离法 c. 盖玻片法盖玻片法1、 形态学特征：形态学特征： 2、肿瘤细胞生长曲线和倍增时间、肿瘤细胞生长曲线和倍增时间1. 染色体数目及核型染色体数目及核型2. 永生性永生性3. 异质性异质性4. 动物接种成瘤性动物接种成瘤性（一）细胞系鉴定的内容：（一）细胞系鉴定的内容：1、鉴定细胞系的纯度、鉴定细胞系的纯度2、细胞系的稳定性、细胞系的稳定性3、细胞学特征、细胞学特征4、微生物污染检测、微生物污染检测5、染色体稳定性、

15、染色体稳定性6、有无细胞系（株）交叉污染、有无细胞系（株）交叉污染1、用途：、用途： a、种属来源、种属来源 b、细胞特征的指标、细胞特征的指标 c、恶化程度的指标、恶化程度的指标 d、检测细胞系有无交叉污染、检测细胞系有无交叉污染 LDH G6PD NP动力学法动力学法 电泳区分法电泳区分法层析法层析法电聚焦分离法电聚焦分离法免疫法免疫法2、检测方法：、检测方法：l组织起源和已传代数组织起源和已传代数l冻存液冻存液l细胞活力细胞活力l培养液：培养基、血清、抗生素等培养液：培养基、血清、抗生素等l溶解后细胞生长特征溶解后细胞生长特征l接种存活率接种存活率l细胞形态细胞形态一、肿瘤细胞对组织浸润

16、的体外研究一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究三、肿瘤细胞的体外分化实验三、肿瘤细胞的体外分化实验四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验六、肿瘤发病机制研究六、肿瘤发病机制研究肿瘤组织肿瘤组织肿瘤癌旁组织和正常组织肿瘤癌旁组织和正常组织基因差异表达分析基因差异表达分析肿瘤相关基因肿瘤相关基因基因功能研究基因功能研究基因定量检测研究基因定量检测研究肿瘤治疗靶点肿瘤治疗靶点肿瘤早期诊断和治疗监测肿瘤早期诊断和治疗监测SiRNASiRNA技术技

17、术基因芯片技术基因芯片技术SAGESAGE技术技术（cDNAcDNA miRNA miRNA）标本处理？标本处理？l实时荧光实时荧光PCRPCR技术技术l微量反应体系微量反应体系lABI 7900ABI 7900TaqManTaqMan MicroRNA MicroRNA Arrays Arraysl2000年，年，RNAi的研究进展被的研究进展被Science杂志评为重大科技突破。杂志评为重大科技突破。l2001年，年，RNAi作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破十大科技突破”。l2002年年12月月20日，日，Science杂志

18、将杂志将“Small RNA & RNAi”评为评为2002年度最耀眼的明星。同时，年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。评为年度重大科技成果之一。l2003年，年，microRNA的研究第四次入选的研究第四次入选“十大科技突破十大科技突破”，排在第四位。，排在第四位。l2005年，年，microRNA的研究第五次入选的研究第五次入选“十大科技突破十大科技突破”。RNA研究的突破性进展，是生物医学研究领域近研究的突破性进展，是生物医学研究领域近20年来，可与年来，可与HGP相提并论的最重大成果相提并论的最重大成果之一。miRNA

19、的产生与功能的产生与功能1.在细胞核内转录成前体转录本转录本miRNA2.被Rnase核酸酶Drosha加工成约70- 90nt的发夹状发夹状pre-miRNA3.转运到细胞质被Dicer加工成成熟成熟miRNA4.双链miRNA分子被解链，单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP(RISC)5.通过与靶基因的3 UTR 区互补配对，指导 miRNP复合体对靶基因mRNA 进行切割切割 或者翻译抑制或者翻译抑制l成熟的成熟的MicroRNA(miRNA)是一种是一种22个个 nt左右的内源性单链小分子左右的内源性单链小分子RNAl由带茎环结构的双链由带茎环结构的双链RNA前体剪切而前

20、体剪切而成成l具有高度保守性、时序性和组织特异性具有高度保守性、时序性和组织特异性l通过与特异通过与特异mRNA结合，抑制目标基因结合，抑制目标基因表达或降解表达或降解mRNAl调节人类三分之一的基因调节人类三分之一的基因（1）发育）发育 Timing (Lee et al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005)（2）细胞死亡）细胞死亡(Baehrecke, 2003) （3）疾病）疾病 肿瘤肿

21、瘤(Lu et al. 2005) 原癌原癌miRNA(He et al. 2005) 脑肿瘤脑肿瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病糖尿病(Poy et al. 2004) （4）胆固醇的生物合成）胆固醇的生物合成(Krutzfeldt et al. 2005)（5）DNA 甲基化与染色质修饰甲基化与染色质修饰(Bao et al. 2004)Northern Blot (杂交法)l常规方法，易于操作l需大量样品(ug级)l动力学范围低（约2个数量级）l错配杂交问题，难以区分通常只有很少序列差别的序列Microarrays (芯片法芯片法)l通量高l可测动力学范围较宽l需大量RNA样品，约5g per array l很难区分前体很难区分前体miRNA和成熟和成熟miRNAl对类似结构的对类似结构的miRNA分辨率差分辨率差Quantitative Real-Time PCR(实时定量实时定量PCR)l只需微量样品l非常宽的动力学范围（7 log）l高灵敏度, 高特异性SiRNA干扰