实时荧光定量PCR技术,原理,应用及实践,第二代染料

1、Real-time PCR基因表达定量北京康为世纪生物技术有限公司北京康为世纪生物技术有限公司2北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司v 康为的目标：成为中国的康为的目标：成为中国的Invitrogen v 完善的产品线完善的产品线v 一站式的服务平台一站式的服务平台您的问题解决专家！您的问题解决专家！3北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司v核酸提取核酸提取vPCR、RT-PCR 及荧光定量及荧光定量PCRvDNA 分子量标准分子量标准v克隆与转化克隆与转化v蛋白提取与纯化蛋白提取与纯化v蛋白定量、蛋白蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品及蛋白电泳产品

2、vWestern Blot产品产品v免疫组化产品免疫组化产品v标签抗体标签抗体v内参抗体内参抗体v二抗二抗完善的产品线完善的产品线4五大平台五大平台 一站式服务一站式服务康为世纪生物科技有限公司康为世纪生物科技有限公司5完善的产品线完善的产品线v分子生物学分子生物学 全系列产品全系列产品v蛋白质学产品蛋白质学产品v免疫学相关产品免疫学相关产品一站式服务平台一站式服务平台v实验设计平台实验设计平台v分子生物学平台分子生物学平台v蛋白表达与纯化蛋白表达与纯化 平台平台v抗体制备纯化平台抗体制备纯化平台v免疫学检测平台免疫学检测平台北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司我们的客户我

3、们的客户我们的合作伙伴我们的合作伙伴v北京大学、清华大学、北京大学、清华大学、 复旦大学复旦大学v中国科学院、军事医学中国科学院、军事医学 科学院科学院v301医院、协和医院、医院、协和医院、 上海瑞金医院上海瑞金医院v华大基因、诺华制药华大基因、诺华制药Real-time PCR基因表达定量北京康为世纪生物技术有限公司北京康为世纪生物技术有限公司PCR： 国王和象棋的故事N = 264 -1 = 18446744070309551615PCR：伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substan

4、ces Belief in astrologyCYCLE NUMBERAMOUNT OF DNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,00

5、0,000321,500,000,000331,550,000,000341,580,000,000PCR：理想与现实l 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能l 终点检测，与看家基因对照，所谓 半定量：不可接受。确定模板初始数量real-time使qPCR成为可能q模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小q模板Log浓度与Ct值呈线性关系Real-time PCR 应用 定量 基因表达水平检测 定量 基因拷贝数检测 多色标记 SNP检测 高精度溶解曲线分析（HRM）- SNP 高精度溶解曲线分析（HRM）- DNA甲基化分析Real-time PCR: 发光原理

6、非特异染料（SYBR Green，SuperGreen） 水解探针（TaqMan 探针） 非水解探针（ Molecular beacon ， 染料法qPCR基因表达水平检测 内参基因内参基因(housekeeping gene)选择选择 样本处理与样本处理与 RNA提取提取 cDNA qPCR墨菲定律：Anything can go wrong that will go wrong!以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度- Ct法法 成立条件：内参基因成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的在相互比较的样本之间表达丰

7、度相同样本之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负正负10%染料法qPCR相对定量Housekeeping gene selectionHousekeeping gene 的概念与定义 不同环境，不同生长与病理状态，不同器官、组织、细胞类型之间表达水平恒定-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax 2002

8、;57:765-770 Housekeeping gene selectionEvidence Based Selection of Housekeeping Genes PLoS ONE. 2007; 2(9): e898Housekeeping gene selection文献检索，挑选恰当 housekeeping gene恰当： 有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeeping gene 没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作Housekeeping gene （特别是-Actin 和 GAPDH ） Housekeeping gene在给定研究条件下的表达丰度最

9、好与目标基因相似通过实验选择Housekeeping gene 实测多个备选Housekeeping gene 以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性参考资料 geNorm 网站 - http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/ Vandesompele et al., Genome Biology, 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal cont

10、rol genesHousekeeping gene selectionHousekeeping gene 康为产品高丰度高丰度 ACTB，GAPDH中等丰度中等丰度 beta2M低丰度低丰度 HPRT1染料法qPCR基因表达水平检测 内参基因选择内参基因选择 样本处理与样本处理与 RNARNA提取提取 cDNAcDNA qPCRqPCR样本处理与RNA提取 外界刺激 10分钟 可检测的表达改变 严格平行操作。样品离开定义环境 2分钟内 裂解、固定细胞 Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 以RNA作PCR阴性对照CW05

11、80CW0592染料法qPCR基因表达水平检测 内参基因选择内参基因选择 样本处理与样本处理与 RNA提取提取 cDNA qPCR逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ 检测何种剪接体？ 是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？一步法一步法 or 两步法？两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段推荐：工作的初期阶段 RealSYBRRealSYBR 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With RO

12、X RealSYBRRealSYBR 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSuperRealSuper 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX一步法：一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段推荐：工作的成熟阶段 RealSuperRealSuper 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX染料法qPCR基因表达水平检测 内参基因选择内参基因选择 样本处理与样本处理与 RNA提取提取 cDNA qP

13、CR反应条件优化Housekeeping gene 单一特异性产物 反应效率大于90%反应条件优化目的基因目的基因 单一特异性产物 反应效率接近housekeeping gene 反应效率尽量高Real-time PCR 总原则与普通PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （70 - 300bp) 目标区段位置：考虑目标剪接体 推荐做跨intron设计EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA引物设计引物设计反应条件优化Master mix的选择 DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs TemplateC

14、WBIO Real-time PCR系列产品 Master Mix的选择 名副其实 Fast RealSuper Mixture（With ROX） Fast：快速复活热启动DNA聚合酶 Real：应用于Real-time Super：使用新型染料，超亮！ Mixture：包括除引物和模板的一切，还有更多！ ROX：含有ROX染料，适用于需ROX校正的仪器 CW0766背景知识 PCR热启动 反应准备阶段 环境温度下引物与模板可发生非特异结合 DNA聚合酶低温下亦有一定活性 产生少量非特异产物 少量非特异产物在后续循环中成为特异模板，产生大量非特异产物 对策 热启动DNA聚合酶 用某种方法抑制

15、DNA聚合酶在低温下的活性 反应第一步升温时恢复DNA聚合酶活性Master mix的优化DNA聚合酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒几十秒 CW0696 CW0704Master mix的优化荧光染料新型荧光染料新型荧光染料(SuperGreen) 激发、发射波长与SYBRgreen近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰更

16、窄，适合于HRM分析 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱SYBR GREEN 染料新型荧光 染料荧光染料 反应条件优化Master mix的选择 Buffer 添加剂的使用 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂. 其它原理.使用添加剂未使用添加剂Master Mix的优化 对仪器的适应性康为MasterMix在多种不同品牌，不同档次，性能各异的Real-time PCR仪上进行优化Master Mix的优化对仪器的适应性 某其它品牌某其它品牌 康为康为采用cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。模板浓度进行10倍稀释，稀释5个梯度，每管做2个平行，同时做

17、阴性对照Master Mix的优化校正染料ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。抗污染污染警报：阴性对照出现阳性结果污染源：先前PCR产物对策：尿嘧啶糖苷酶（UNG）尿嘧啶DNA糖基化酶 （UDG）方法： 反应中用dUTP取代dTTP 反应中加入UNG 反应升温前在37oC孵育数分钟，使UNG降解含UTP的DNA（先前PCR产物）Trouble shootingHousekeeping geneHousekeeping gene 无信号无信号RNARNA降解

18、降解用新鲜组织提取用新鲜组织提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目标基因无信号而目标基因无信号1. 1. 目的基因表达低。目的基因表达低。 逆转录效率不高逆转录效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3. 3. 尝试不同尝试不同PCRPCR引物。减小产物大小，改换目标引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。区段，考虑不同剪接体。4. 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。尝试不同热循程序

19、，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反应效率正常反应效率正常, ,但但目标因放大效率不高目标因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体考虑不同剪接体目标基因表达丰度在目标基因表达丰度在样本之间异常一致样本之间异常一致RNARNA被基因组被基因组DNADNA污染污染1.1.使用跨使用跨intron intron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处理处理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性对照表现阴性阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰溶解曲线出现杂峰1.1.出现非特异出现非特异PCRPCR产物产物2.2.出现引物二聚体出现引物二聚体1.1.尝试不同尝试不同PCRPCR引物引物2.2.尝试不同热循程序，升高复性温度尝试不同热循程序，升高复性温度3.3.修改仪器