聚合酶链式反应(PCR)技术

1、实验七实验七 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 1. 实验目的2. 实验原理3. 实验仪器、材料与试剂4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论实验目的掌握PCR反应的原理及技术。 实验原理实验原理聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称）简称PCR技术，是一种体外技术，是一种体外扩增特异扩增特异DNA片段片段的技术。的技术。利用利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序序列的拷贝。列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。方面得到

2、广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板技术实际上是在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。结合的特异性。 PCR：变性退火延伸变性退火延伸PCR反应分为三步：反应分为三步：1.变性：变性：在高温条件下，在高温条件下，DNA双链解离形成单链双链解离形成单链DNA；2.退火：退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；在局部形成杂交链；3.延伸：延伸：在在DNA聚合酶、聚

3、合酶、dNTPs和和Mg2+存在的存在的条件下，聚合酶催化条件下，聚合酶催化以引物为起始点以引物为起始点的的DNA链链延伸反应。延伸反应。以上三步为一个循环，以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，片段得到了大量复制，数量可达到数量可达到1067个拷贝个拷贝。 PCR技术的参数主要有技术的参数主要有7个：个： 聚合酶、引物、聚合酶、引物、dNTPs、反应、反应buffer、二价、二价离子、模板、一价离子。离子、模板、一价离子。 实

4、验仪器、材料与试剂（一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 （二）材料 模板DNA （三）试剂 1. 10 x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 5u/l 4. 引物1和2( 2mol/L) (T3,T7)5. 模板实验步骤1. 在0.2ml Eppendorf管内配制50l反应体系 ddH2O： 33.5ul 10 x PCR buffer： 5ul dNTPs（2.5mM）： 4ul 引物1 (2uM)： 1ul 引物2 (2uM)： 1ul MgCl2 3ul Taq 酶： 0.5ul 模板： 2ul 共50ul 体系2. 按下述

5、循环程序进行扩增按下述循环程序进行扩增 94 5分钟，分钟，1个循环；个循环； 94 30秒，秒，52 30秒，秒，72 30秒，秒，30个循个循环；环； 72 延伸延伸10 分钟。分钟。 4保温。保温。 3. 扩增结束后取扩增结束后取50l扩增产物，利用琼脂糖电扩增产物，利用琼脂糖电泳检测泳检测DNA扩增情况扩增情况,并切胶用于回收并切胶用于回收. 实验结果与讨论实验结果与讨论PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。会，以免出现目的条带以外的杂带。如退火温度过低，也可能出现杂带。如退火温度过低，也可能出现杂带。 1 2 3 4

6、 5 6 7 8 9 10 11 12 13 MPCR引物设计引物设计长度：互补序列大于长度：互补序列大于20，没有上限。，没有上限。两引物具有较好的协调性；两引物具有较好的协调性；内部二级结构较少；内部二级结构较少；加酶切位点时需要注意保护碱基长度；加酶切位点时需要注意保护碱基长度；检测特异性；检测特异性；大引物与定点突变。大引物与定点突变。3端绝对不能互补；端绝对不能互补；制品说明 本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。 使用本试剂盒每次可纯化得到多至10 mg的DNA片段（100 bp30 kbp)，回收率高达50 80。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PC