蛋白质分子定向进化其他方法

1、蛋白质分子定向进化其他方法自然界在长期的进化过程中.产生了许多具有重要功能的符合人们需要 的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，贝y往往不能满足 人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工 业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过 程。自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的 修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计(rati onal design),但蛋白质结构的复杂性极大地增 加了合理设计的难

2、度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不 清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化(molecular directed evolution)策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需 要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需 性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子 多样性(突变和/或重组)；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那 些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这

3、个过程直到达 到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径； c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。每 一步都可以有多种方法。常见的定向进化方法有：易错PCR技术DNA改组技术外显子改组 交错延伸重组随机引物体外重组法(RPR)。当然还有其他的方法，下 面就来给大家一一介绍。一、随机诱变化学诱变剂介导的随机诱变体外随机诱变也可在65C下直接用羟胺处理带有目的基因片段的

4、质粒， 然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变美国stratagene公司构建了一株DNAI复途径缺陷的大肠杆菌突变株 XLI-Red，它体内的DN庚变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒 转化到XLl-Red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。每两千个碱 基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中 进行筛选。连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突 变体作为下一代的亲本。通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。定点突变和定点饱和突变技术定点突变

5、技术(Site directed mutagenesis)般用于对DN分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。 早在1978年Michael Smith 就运用寡核苷酸进行定点突变。定点突变的基本原理是首先合成一段含有突 变碱基的DNAI物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链DN上，用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞 并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式 诱变和多种基于PCR勺突变方法，最常见的有重叠PC等方法。当靶位点氨基 酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技 术，此方法是要着

6、重寻求靶位点的最适氨基酸。定点突变和定点饱和突变技 术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。组合活性中心饱和突变试验组合活性中心饱和试验(combinatorial active .site saturation test ,CAST的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接 近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有 潜在的协同作用。因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。这是单点 突变不能做到的。如果选择的氨基酸对应的位置是 n,贝卩第2个氨基酸的选择 遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第 n+1位； 若在B折叠上则选择第

7、n+2位，若在310螺旋上，则选择第n+3位；若在a螺旋 上，则选择第n+4位。对于CAS突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要 进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成 20种氨基酸的任何一种。以2NNK(代表任何一种核苷酸，K代表是G或 T)作为突变的碱基形式，则有32=1 024种不同的组合，而氨基酸则可突变成 202=400种不同的组合。因此，要将 每个库的所有突变的覆盖率达到95%，则每个库至少要挑3000个克隆子。此外，近年来还发展出了更多的、新颖的无性突变技术。例如，三核苷 酸突变(TriNex)，随机插入-删除突变(RID)，序列饱和突变(SeSaM)以及它 的改进方法SeSa

8、Tv+。这些方法都是为了能最大程度的增强突变体库的多 样性，丰富并延伸无性突变的方法手段。二、基因体外重组限制性酶切-再连接介导的基因重组(recombining the genes by restrictio n and religatio n)利用限制性内切酶对欲重组的两个以上 DN序列进行酶切，然后在连接 酶的作用下随机重新连接起来，可实现 DN分子问的重组。实验证明，简单 的酶切-再连接可进一步提高对硝基苯酯酶的活性。但如果两个正突变处于 同一段限制性酶切片段上，贝S无法将它们重组于同一序列中。基因家族改组在基因改组的基础上，1998年由Crameri等提出了基因家族改组技术 (DNA

9、 family shuffli ng)，至此才是真正的有性重组的开始。基因家族改组 与单基因改组最大的区别在于出发序列的同源性。利用基因家族同源序列进 行DNA改组，实现同源重组。由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对 有益或无害的片段，所以基因家族改组的突变机率和改组效率明显提高，体 现了基因的多样性。过渡模板随机嵌合生长过渡模板随机嵌合生长(random chimeragenesis on transient templatesRACHITT )技术是与DNA shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重 组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因 片段杂

10、交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接(图2) 其中的悬垂切割步骤使短片段(比 DNase消化片段还短)得以重组，明显提 高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均 每个基因含14个交叉，重组水平比DNA shuffling类方法(14个交叉)高出几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所难以达到的。會尿略摩的另一亲本基禺的 尸桂低为釉时耳丁礙横脈I娶剪曇垂呼列、单补空、连接J統劇.模梅睜列引人F代厳和体碎去昨架輕板龊制51

11、橇菟履和歸粧Fig. 2 Tht general procedure of RACHTn9-1图2 RACHITTS基本程序®酵母增强组合文库酵母增强组合文库(comb in atorial libraries enhan ced byrecomb in ati on in yeast, CLER Y)是一个真核基因家族 shuffli ng 策略。其 原理是将体外DNA shuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来，构建高 丰度低亲本水平的重组文库：直接以含目的基因的质粒作为体外shuffli ng的模板；shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动

12、体 内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。Trua n等用该法重组人细胞色素P450 1A1和1A2，所得文库含86%的嵌合基因，大大提高了文库丰 度；另外，用单链DNA做shuffling的模板可进一步降低文库中的亲本比率。 该法为蛋白质结构/功能研究、多组分真核复合酶活力的调控提供了一个新 的有力工具。渐增切割法产生杂和酶尽管DNA shuffling介导的重组已成为定向进化创建高质量序列多样性 的重要工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70%80%的序列。而自然 界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。为了解决这个问题，Ben kovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（

13、in creme ntal trun cation for the creation of hybrid enzymes ITCHY ）及Thio-ITCHY （ a -硫代磷酸核苷酸介 导的ITCHY ）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。ITCHY的基 本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10碱基/ min ,然后间隔很短 时间连续取样终止反应，以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将 基因A的一组随机长度的5端片段与基因B的一组随机长度的3端片段随机 融合产生杂合基因文库。但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先将待PCf反应或单链模板引

14、伸反应将a -硫代磷酸核苷 酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶皿的切割，接下来的切割反应会在 此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库该法操作便利，同时也可 引入随机点突变。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在 非序列同一区内产生活性融合子。迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可 以创造多个交叉。不依赖序列同源性的蛋白质重组尽管上述ITCHY可以进行不依赖于序列同源性的重组，但它是一个随机长度片段与另一个随机长度片段相融合，结果文库中基因长度不再保守，子 代中功能杂合子的比率很低。要想提高功能杂合子所占比例，须使交叉发生 在具有相似结构环境的位置

15、，但由于缺乏足够的序列相似性，同源重组不能 发挥作用，因此Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequeneehomology-i ndepe ndent protein recomb in ati on, SHIPREC )方法：通过琼脂 糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使 交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两 个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。该法可以在低序列同一性甚至无序列同一性的同源蛋白质间创造 具有单交叉的杂合蛋白质组合文库。迭代 SHIPREC可以产生多个交叉。随着

16、酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继 开发出另一些新方法，如设计的寡核苷酸装配 (assembly of desig ned olig onu cleotides , ADO)诱变和单向重组 (mutage nic and uni directi onal reassembly，MURA)随机插入-删除链交换突变(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于 Y连接的构件改组(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)合成改组(syntheticsh

17、uffli ng)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也为更好的进行定向进化提供了强有力的工具和指导思想。三、文库筛选策略一旦多样性文库构建好后，定向进化实验成败与否的关键则在于“要有 针对目的改造特征的高效筛选方案”。近几年，与创建多样性重组文库的发 展相适应，在高流通量和超高流通量筛选技术方面也取得另人瞩目的成就。 其中核糖体展示技术与mRNA展示技术，由于在体外无细胞翻译体系中进 行，不受细胞转化效率的限制，大大提高了文库容量和筛选通量(10121014)。 它们的原理是通过筛选靶蛋白-核糖体-mRNA三元复合物或靶蛋白-mRNA二 元复合物，将基因型与表型直接偶联起来，并利用mRNA的可复

18、制性，使靶基因(蛋白)得到有效富集。利用此法进化单链抗体可变区scFv片段，获得亲和力提高40倍的变异株其他高通量筛选方法，如细胞表面展示技术和噬菌体表面展示技术；将 靶活力与转录信号相偶联的三杂交体系；以发光信号为指示的反射增进系 统；利用荧光信号的荧光共振能量转换仪（FRET，结合荧光激活细胞筛选 仪（FACS），每小时可筛选60000个细胞。最近Chadessy等还报道了一种隔 室化自复制技术，通过一个只复制其自身基因的聚合酶组成的简单反馈环将 体外进化与筛选有机结合起来，使阳性克隆得到快速、高效的富集，获得热 稳定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突变株。在硬件

19、设备方面，1536和3456孔板以及多通道多波长检测仪的出现、 每秒钟分配几千滴皮升级样品的非接触式压电配样仪的问世等都大大提高 了样品处理速度。定向进化的意义定向进化不仅在工业、医疗方面对蛋白质的改造具有重要的意义，而 且，它也非常适合于基础理论的研究。对蛋白质分子进化得到的突变体进行 分析，为研究蛋白质的结构和功能的关系提供了新的工具。天然蛋白质序列 中往往有很多是随机遗传漂移，而不是功能性的适应。例如，从适应不同环 境的物种中提取出的蛋白质经常有几十个氨基酸的不同，其中只有一小部分是与特定功能差异有关的。大量的中性突变只能干扰科学家辨别分子的规 律。在实验室的进化实验中，种系很清楚，而且

20、突变主要是适应性的。Amold 等人使用高保真DN改组成功地区分出基因中的功能性和非功能性突变。通 过定向进化来研究蛋白质的结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理论依据。参考文献1. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看详情外文期刊19972. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看详情外文期刊1997(94)3. Gree ner A;Callaha n. M Perform Ran dom Mutage nesis 19944.Seiichi Taguchi;Akiyoshi Ozaki;Haruo Momose查看详情外文期刊1998(

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